潘 玉纯
南方医科大学附属深圳妇幼保健院产前诊断中心, 广东 深圳 518000,
Prenatal Diagnosis Center, Shenzhen Maternity and Child Health Care Hospital, Southern Medical University, Shenzhen, Guangdong 518000, China
深圳市出生缺陷预防控制重点实验室, 广东 深圳 518000
吴 维青
南方医科大学附属深圳妇幼保健院产前诊断中心, 广东 深圳 518000,
Prenatal Diagnosis Center, Shenzhen Maternity and Child Health Care Hospital, Southern Medical University, Shenzhen, Guangdong 518000, China
深圳市出生缺陷预防控制重点实验室, 广东 深圳 518000
谢 建生
南方医科大学附属深圳妇幼保健院产前诊断中心, 广东 深圳 518000,
Prenatal Diagnosis Center, Shenzhen Maternity and Child Health Care Hospital, Southern Medical University, Shenzhen, Guangdong 518000, China
深圳市出生缺陷预防控制重点实验室, 广东 深圳 518000
罗 彩群
南方医科大学附属深圳妇幼保健院产前诊断中心, 广东 深圳 518000,
Prenatal Diagnosis Center, Shenzhen Maternity and Child Health Care Hospital, Southern Medical University, Shenzhen, Guangdong 518000, China
深圳市出生缺陷预防控制重点实验室, 广东 深圳 518000
郝 颖
南方医科大学附属深圳妇幼保健院产前诊断中心, 广东 深圳 518000,
Prenatal Diagnosis Center, Shenzhen Maternity and Child Health Care Hospital, Southern Medical University, Shenzhen, Guangdong 518000, China
深圳市出生缺陷预防控制重点实验室, 广东 深圳 518000
南方医科大学附属深圳妇幼保健院产前诊断中心, 广东 深圳 518000,
Prenatal Diagnosis Center, Shenzhen Maternity and Child Health Care Hospital, Southern Medical University, Shenzhen, Guangdong 518000, China
深圳市出生缺陷预防控制重点实验室, 广东 深圳 518000
Blood Kit（Qiagen公司生产）试剂盒提取基因组DNA，操作步骤按照说明书。检测DNA纯度和浓度（Nanodrop2000蛋白核酸分析仪），要求DNA纯度在1.8~2.0之间，浓度在20~100 ng/μL之间。
1.3. TSC相关基因高通量测序分析
委托深圳华大临床检验中心将先证者DNA打断并制备文库，通过定制芯片对TSC1和TSC2目标基因的编码区及邻近剪切区的DNA进行捕获和富集，最后使用高通量测序平台进行突变检测。检测基因目标区长度约26 579 bp，目标区覆盖度95%以上，目标区平均深度509.58×，目标区平均深度>30×位点所占比例为100%。
1.5. PCR扩增
应用立陶宛Thermo Scientific公司试剂，反应体系：ddH
2
O 15.5 μL，Buffer、Mg
2+
、dNTP各3 μL，正反引物各1 μL，Taq DNA酶1.5 μL，模板DNA 2 μL，总体系为30 μL。扩增条件：96℃
3 min预变性；94℃ 1 min变性，退火1 min（相应退火温度见
），72℃延伸1 min，35个循环；72℃ 3 min，使PCR反应完全以提高扩增产量。取扩增产物5 μL，TaKaRa公司生产的6×Loading
Buffer 1 μL，混匀，2%琼脂糖（Biowest Agarose）凝胶电泳以验证产物特异性。
1.6. PCR产物序列测定
取PCR扩增产物25 μL，用
中PCR扩增引物作测序引物，测序委托上海生工公司完成。具体步骤如下：PCR产物纯化（生工公司纯化试剂）；2%琼脂糖凝胶电泳确认其纯度和浓度（Biowest Agarose琼脂糖粉，生工公司的marker）；根据PCR产物长度确定DNA模板浓度（长度为200~500 bp的模板用量为2~10 ng），DNA测序反应（ABI PCR仪，美国）；产物上机前用酒精纯化；上测序仪（ABI 3730XL）；采用Chromas软件分析数据。
2. 结果
家系1先证者检出TSC2基因c.3981-3982
insA（p.Asp1327AspfsX87）杂合突变（
），先证者父母该位点均未见异常。该框移突变导致氨基酸序列在第1413位提前终止编码，其致病性尚未见文献报道。家系2先证者、先证者母亲均检出c.4013-4014 delCA（p.Ser1338Cysfs）杂合突变（
），为母源性遗传，先证者父亲、先证者外祖父母该位点均未见异常。该框移突变导致氨基酸序列在第1412位提前终止编码，其致病性亦未见文献报道。
两突变在HGMD数据库（www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）里未查出；在千人基因组计划数据库中检出频率为0；在深圳华大基因收集的大于200例本地正常人测序样本中的发生频率为A（发生频率0~0.01为A；0.01~0.05为B；0.05~1为C）；用Mutationtaster软件（www.mutationtaster.org/）对其进行突变功能预测，预测分数均为1（预测结果分数范围为0~1，分数越高提示致病可能性越大）。
3. 讨论
TSC1编码的错构瘤蛋白和TSC2编码的马铃薯蛋白二者在细胞质内形成复合物，间接调控细胞增殖、细胞分裂和细胞黏附等，当任一基因发生突变时，胞内复合物形成受阻，对细胞增殖的抑制作用减弱或消失，造成细胞增殖过快而出现错构瘤损害
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。TSC1-TSC2复合物在细胞中发挥作用是通过TSC2的GAP功能域（GTPase激活蛋白）间接激活哺乳动物雷帕霉素靶蛋白途径（mTOR），进而通过核糖体蛋白S6激酶（S6K）去磷酸化以达到抑制蛋白质合成、细胞生长、增殖和自我吞噬的作用
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。因此，TSC1-TSC2复合物形成异常、TSC2基因突变造成GAP域异常和mTOR磷酸化水平异常，均可出现TSC相关临床表现。TSC2基因主要有两个功能域，即Hamartin结合域和GAP域
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，经Swiss-prot软件（www.uniprot.org/）在线查询可知GAP功能域位于第1531~1758位氨基酸，本研究讨论的TSC2基因c.3981-3982
insA（p.Asp1327AspfsX87）突变导致氨基酸序列在第1413位提前终止编码，c.4013-4014 delCA（p.Ser1338Cysfs）突变导致氨基酸序列在第1412位提前终止编码，二者均终止于GAP功能域前，导致GAP域全部缺失，为两家系的致病原因。
有不少国内外文献已报道错义突变、无义突变和框移突变导致GAP功能域异常，从而引发疾病。Mayer等
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曾报道1例临床症状较轻的TSC，发现TSC2基因c.4684G>A（G1556S），此错义突变位于GAP域内，导致非极性的甘氨酸变成极性的丝氨酸，抑制S6K磷酸化的能力减弱，引起信号通路异常而致病。Chen等
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在产前诊断中发现1例TSC2基因无义突变，即c.4830G>A（W1610X），此突变造成氨基酸编码发生提前终止，GAP功能域部分缺失，引起心脏横纹肌瘤和脑内异常等表现。Yu等
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报道1例致病性的缺失突变TSC2基因c.2690delT（p.Phe897SerfsX947），此框移突变导致GAP功能域完全缺失，引起一系列临床症状。
本研究讨论的TSC2基因c.3981-3982 insA、c.4013-4014 delCA在HGMD数据库（www.hgmd.cf.ac.uk/ac/index.php）里未查出；在千人基因组计划数据库中检出频率为0；在深圳华大基因收集的大于200例本地正常人测序样本中的发生频率为A（发生频率0~0.01为A）；用Mutationtaster软件（www.mutationtaster.org/）对其进行突变功能预测，预测分数均为1（预测结果分数范围为0~1，分数越高提示致病可能性越大）。经过文献复习、氨基酸结构分析，结合先证者临床表现等，推测这两个框移突变为新发的致病性突变，但是突变蛋白功能仍需要细胞模型和动物模型的进一步验证，突变体结构需要X衍射等技术的检测。
TSC2基因大，致病突变数量多，嵌合型比例高，基因检测非常复杂。明确基因突变有助于TSC家系遗传咨询和利用分子遗传学方法进行早期产前诊断。Curatolo等
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在研究TSC基因型与表型的关系中阐明，TSC2突变引起的临床症状较TSC1更严重，如更易发生智力低下、癫癎、面部血管纤维瘤等。本研究中TSC2基因两突变先证者均有癫癎和面部血管纤维瘤表现，其中c.3981-3982
insA突变患儿临床表型严重，发病年龄较小，而c.4013-4014 delCA突变患儿表型较轻，智力发育正常。由于c.3981-3982 insA突变导致腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）
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介导的磷酸化功能缺失，而c.4013-4014 delCA突变后此功能尚存在，因此推测这是TSC2基因c.3981-3982 insA突变较c.4013-4014 delCA表型严重的原因。
综上，本研究检出的TSC2基因c.3981-3982
insA、c.4013-4014 delCA突变为新发致病性框移突变，这两个新发突变的发现不仅丰富了基因突变谱，也为患病家系产前基因诊断提供了依据。
