在体外研究中,PGF ₂₊ 是排卵31的有力诱导 ^{剂,而在体内,它可以诱导 拉纳 肌肉4、30、32的保留卵子的排卵。 纤维提取物也是排卵 的有效 诱导剂15,16,34; 然而,在考虑这种方法时,对生物安全和疾病传播可能性的担忧往往对圈养繁殖地的阻碍。}

本文的最后一节详细介绍了外科手术,并提供了其他方法来扩大卵巢研究或帮助解决生殖病理。在两栖动物中最常进行卵子切除术,以获得卵母细胞用于胚胎学研究。但是,当其他选项失败时,它还可以为保留的鸡蛋提供补救措施。虽然这个程序是侵入性的,需要完全麻醉和切口来暴露卵子质量,但它不需要安乐死。此外,在部分卵巢切除术后,动物可以完全恢复,并在手术后继续繁殖活跃。

下面描述的协议概述了在阿努兰和考斯进行卵巢控制和监测的侵入性和非侵入性方法。选择在阿努兰人中说明技术的特定物种包括 粘胶 和X.拉维瓦。 Necturus maculosus、 N. Beyeri、 N. 阿拉巴门斯 和 A. 墨西哥 构成用于类似描述考达特技术的物种.

萨拉曼德程序由辛辛那提动物园和植物园 (CZBG) 机构护理和使用委员会 (IACUC) 协议 11-106、 13-110、 14-133 和 15-138 批准。所有青蛙和蛤类程序都通过了圣地亚哥动物园全球(SDZG),机构护理和使用委员会(IACUC)协议:15-001,16-005和18-003。

国家自然历史博物馆(巴黎)伦理委员会根据《国家自然史博物馆》和《植物保护》原则批准了动物的护理和治疗。(Génie Génétique委员会,《服务服务方向》,欧洲联盟第2010/63/欧盟指令,协议第20号决定。C75-05-01-2,用于实验和其他科学目的的脊椎动物欧洲公约。本研究中使用的所有协议均以参考号68-037获得批准。

1. 非侵入性卵巢监测技术

1. 目视检查和触觉
   1. 用下面描述的三种方式之一握住女性阿努兰。
      1. 用戒指和小手指固定青蛙或蛤的腿,用食指和中指支撑青蛙身体的背侧(腹部),用拇指支撑腹腔侧( 图1A)。
      2. 用拇指在腹部抓住青蛙或蛤蛤,其余手指固定动物的背部。使用非主导手来触手可及动物的腹部,感觉是否有皮下凸起( 图1B)。
      3. 把青蛙或蛤的腹部放在手掌上,前臂覆盖在食指上,拇指放在上背部。
      4. 由于牛科特在自然界中是完全水生的,因此通过下面描述的两种方法之一进行目视检查。
         1. 将动物移到一个单独的 4 L 容器,其中包含水箱水。举起容器(盖固定),将手电筒照射在底面,以可视化鸡蛋的存在/不存在。
         2. 在 MS222 中麻醉 (0.5 g/L;三甲甲甲酸酯,缓冲0.5M NaHCO ₃ 。感应后,将动物旋转到背部并检查腹部。
         3. 阿努兰斯
            注:无需麻醉。
            1. 使用卡钳,测量动物从嘴尖,沿着身体的中心到尾巴的尖端,以获得SUL和SVL( 图2A,B)。
            2. 以数字精密尺度处理塑料容器。将动物放入柏油容器并称重( 图2C)。
            3. 对于较大的动物,如牛蛙,或在野外获得重量时,请使用悬挂秤( 图2D)。
            4. 与许多阿努兰物种一样,根据体型较大和手上缺乏婚礼(拇指)垫来 区分R.Muscosa 成年雌性( 图3)。
            5. 计算身体状况,作为对整体健康状况的基本评估,公式如下:
               富尔顿的索引:K = 质量 = 长度 ³
               注: 富尔顿索引使用与质量和长度相关的体积的维度平衡,其中 ³ 是以等轴测方式关联质量和长度的缩放指数。
            6. 在将非麻醉动物放入内之前,用空袋子进行量表。注意不要引入多余的水( 图2D), 并迅速采取行动,因为动物分泌粘液作为被抑制的压力反应。
            7. 通过在可重新密封的塑料袋底部或可以容纳膨胀卡钳的单独塑料容器中固定个人,获得成人测量。
            8. 使用卡钳测量车身长度 ( 图 2E )。
            9. 测量从鼻尖到尾端 (SVL) 的翘尾,以监测生长。
            10. 实时物理观察动物或使用摄像机记录行为。
            11. 记录动物观察对行为进行分类并构造一个内造图( 图4)。
            12. 对生殖行为进行分类
                注: 图4 举例说明了在阿努伦观察到的一种生殖行为。
            13. 超声
                注:选择的超声传感器,在这种情况下,7.5 mHz线性或多频(10-6千赫)微凸,建议 用于Necturus 和10 MHz探头和水溶性,无盐凝胶R.mussa。 对蜥蜴进行超声波检查可能需要麻醉(有关说明,请参阅第 1.5 节)。
                1. 使用两个人 对R.Muscosa 执行超声波检查( 图5A)。
                2. 第一人称:用主导手握住动物,将水溶性、无盐凝胶涂在动物腹部。
                3. 第二人称(超超声学家):将10 MHz探头放在主导手上,并将其涂抹在腹部,确保探头与凝胶之间保持良好的接触。
                4. 从手臂坑下方向内滑动,朝动物腹部中线中心滑动,以可视化整个卵巢。
                5. 超超声学家:使用非主导手冻结帧,并在超声波上捕捉所需的图像。
                6. 根据为 ^属4 建立的分级系统对卵巢周期的阶段进行分类( 表2,图5B-F )。
                7. 在手术结束时冲洗动物的任何凝胶。
                8. 将非麻醉 的Necturus 转移到4L矩形容器中,里面装满了2L的水箱水。
                9. 通过关闭房间灯和/或将一只手托在动物头上,尽量减少动物运动。
                10. 将传感器放置在距车身壁 1-2 厘米的距离处。
                11. 找到心脏在腹腔中线水平到前肢,然后移动传感器出,并检查卵巢组织7。
                12. 根据为 ^属4 建立的分级制度对女性进行分类(图6A、B、C)。
                13. 当动物的身体与传感器成一定角度时(即,不是线性的,而是轻微的弧形的)时,通过捕捉图像,在中后期的重力阶段获得精确的卵子测量; 图 6B .否则,重叠的卵泡使得很难区分单个卵子的大小。
                14. 麻醉诱导和恢复
                    1. 在 MS222 中麻醉 (0.5 g/L;如前所述,三氧化二甲酸酯缓冲(0.5M NaHCO _3)。
                    2. 使用正确的反射作为动物麻醉程度的主要指标。完全反射损失表明深度麻醉状态。
                    3. 一旦正确的反射丢失,将动物从水浴-基于麻醉(MS-222)中取出。
                    4. 将动物放在湿毛巾上(用无麻醉剂脱氯水)。
                    5. 在整个外科手术过程中,确保保持动物的湿润。
                    6. 用红色橡胶导管、未铐住的管子或经典袖口内切管插入小型两栖动物,而不会使袖口膨胀。
                    7. 提供低流量的氧气(0.5-0.75 升/分钟),含0.5-1%的非氧。
                    8. 手术后停止共和体,但保持氧气流动1分钟。
                    9. 给动物排泄,用无麻醉的脱氯水彻底冲洗动物2分钟。
                    10. 将动物放入浅量的去氯化水中或湿毛巾上。
                    11. 通过轻轻拉动后肢以拉长,评估动物的恢复情况。肢体的任何反应收缩都表示戒断反射。
                    12. 监测其他恢复指标,如肺气囊呼吸(咽喉运动)和右反射。
                    13. 考虑当所有反射都恢复的两栖动物,心脏和呼吸速率已恢复到麻醉前值。
                    14. 在MS222(0.5克/升三甲甲酸酯)中 麻醉Necturus 和Ambystoma, 在4L矩形罐中用0.5M NaHCO _{3(MS222)缓冲。}
                    15. 将空气石(1 英寸)和空气泵放入油箱,并将其打开至恒定的流量,以提供足够的氧合。
                    16. 当肢体功能和右反射丧失时,将动物从水浴-基于麻醉(MS-222)中取出,并将动物放在湿毛巾上(无麻醉脱氯水)。
                    17. 用一瓶罐水挤压保持皮肤和刺的水分。
                    18. 为了找回动物,小心地将其放在一个4L的塑料容器中,里面装满了2L的水箱水,里面装有空气石。
                        注:恢复从刺闪烁开始,然后是移动尾巴和向前推进,最后四肢功能运动的能力。
                    19. 在接下来的 24 小时内,将动物返回到其原始外壳水箱并密切监控。
                        注:两栖动物的其他麻醉方法存在,这些方法在赖特和 ^惠特克8 中描述。

                    2. 侵入性卵巢监测和控制技术

                    注:这个程序已经适应了Forzón ^等人10。

                    1. 抓住青蛙在占主导地位的手,用无菌抹布或纱布擦干青蛙脸上的静脉穿刺侧。
                    2. 擦干面部,避免血液过多地分散在皮肤上。
                    3. 插入针头(26 G 1/2″和 27 G 1/2″),斜面朝上,穿过眼部周围凸起的皮肤和上颌脊相接的皮肤,形成三角形的点(黄色轮廓)(图 7A), 接近 面额面部 护理 维纳轨道 后。
                    4. 刺穿右眼下方和上颌脊上方的面部静脉,从眼睛中线回到1-2毫米之间( 图7A)。
                       注:对于较小的青蛙(低于 20 g),将插入点移近于眼睛中线正下方的位置。
                    5. 将微造血球管向下倾斜,使重力帮助血液流入管中。穿刺后血液应立即流动( 图7B,C)。
                    6. 在血流的第一个迹象,将微血球菌管的尖端放在穿刺部位,收集1-2个满的微血球管,并将管子放入适当的贮器中进行收集( 图7B,C)。
                    7. 如果血液不能轻易流动,或体积非常低,则稍微移动插入针头或将针头插入面部的另一侧。
                    8. 将纱布牢固地压到穿刺部位至少 20 秒,从而停止出血。
                    9. 将青蛙从水中离开10分钟,以确认穿刺部位不重新开放。
                    10. 对取样的每个青蛙使用新的针头和新的微血红管。

                    3. 激素诱导

                15. 在使用前立即准备激素注射,以确保最大效果。
                16. 从 表1 中列出的选择中选择一种激素。
                17. 使用 ^体重16 的μL或mL/g确定要注射的激素的浓度。
                18. 稀释激素在以下之一:水,磷酸盐缓冲盐水(PBS),盐水两栖环线溶液(SARS)或盐水。
                19. 对于体重为 30-70 g 的青蛙,不要超过 200 μL 的注射体积,对于体重为 80-110 g 的青蛙,不要超过 200 μL 的注射体积(个人观察) ¹⁶ 。
                20. 为了在激素给养过程中正确持有10-100克的任何动物,请使用第1.1节所述的任何适当方法进行饲养。
                21. 使用每体重计算一克(g/体重),计算每人所需的浓度。
                22. 就在管理之前,在无菌稀释物的选择中重新组织。
                23. 在注射前,确保注射器中未留有气泡。
                24. 将动物牢牢地握在非主导手上,用主导手进行注射。
                25. 根据激素规格进行注射。最常见的注射在阿努兰是下皮,腹内或肌肉内( 图8 )。
                26. 在腹部下部或靠近后腿的身体部位或下部进行IP注射( 图9)。
                27. 最好在后腿上进行肌肉内注射。
                28. 考蒂斯 ( 内图斯 )
                    1. 根据上述每个体重的克法,在无菌水中重组选择的激素。
                    2. 在Necturus的情况下, 使用1.7-2.3 μg GnRH/g体重的剂量。
                    3. 从麻醉室 中取出Necturus, 放在45°表面上,上面覆盖着手术窗帘。
                    4. 用头朝下放置动物。
                    5. 以 15-20° 角度接近腹部的后象限(后腿的尾部)。小心不要将空气引入注射器。
                    6. 使用胰岛素注射器和 27-30 G 针头注射 (IP)。
                    7. 使用胰岛素注射器和27-30G针头注射激素。

                    4. 外科

                    1. 一般手术准备和程序
                       1. 要维持无菌程序,请使用透明无菌塑料窗帘隔离手术部位。通过保持周围皮肤湿润来减少蒸发。
                       2. 用无菌水润湿任何会接触动物皮肤的材料。使用 15 号或 11 号手术刀进行皮肤切口。
                          注:冷钢、放射外科或二极管激光的组合。轻度出血手术中的止血可以通过电烧机或二极管激光来实现。
                       3. 使用棉尖矛或施用器,允许对小血管施加局部压力,以跟踪失血情况。
                       4. 使用棉尖长矛或施用器管理小密闭空间,而不是标准纱布方块。
                       5. 对体重小于1公斤的动物进行手术时,使用微型仪器,如眼科仪器,用细小的提示。
                       6. 使用塑料、自固定式缩回器(例如,孤星缩回器)来安装不同尺寸的切口。
                       7. 使用眼睑缩回器缩回眼缩切口。
                       8. 必要时使用放大仪器对小患者进行手术。
                          注:两栖动物的任何外科手术都需要麻醉。在手术期间未能给予适当的麻醉,与正常功能的延迟恢复有关。此外,麻醉剂可有效麻醉药物的作用( 表3)34。
                       9. 一 旦X.laevis 被麻醉,如步骤1.5.1所述,将动物置于背退性( 图10A,C )。
                       10. 在手术现场用稀化波维酮碘溶液(1/10)在手术部位用10-15s或0.75%氯西丁溶液在手术现场至少10分钟进行无菌处理。
                       11. 在中圆锥体(肩部和氯卡之间)进行 3 mm 的副中位皮肤切口,用一条大胆的笔触留下一个干净的切口,使用 15 号或 11 号手术刀。
                           注:可以使用二极管激光也用于皮肤切口。
                       12. 抬起腹膜,制作和切口,并使用15号或11号手术刀仔细解剖。( 图10B ,D .
                       13. 用眼睑缩回器(或任何适当的设备)缩回眼缩切口。
                       14. 去除一部分蛋质量,而不沾上任何血管。
                       15. 对于完整的卵巢切除术,通过电烧或激光二极管烧灼周围血管( 图11)。
                       16. 使用单丝缝合线,关闭切口与中断,不断缝合模式。
                       17. 一 次 墨西哥 已经麻醉,把它放在右侧复位,左骨盆肢体简单地放在对尾基。
                       18. 将湿润无菌纱布与稀化的化比酮碘溶液(1:10)放在现场10-15秒,无菌地准备手术现场。 或者,使用浸泡在0.75%氯西丁溶液中的无菌纱布,并在手术现场放置至少10分钟手术前( ^{图12A)36,37。}
                       19. 在肩部和后肢之间画一条线,将身体分成三个相等的部分( 图12B)。
                       20. 在第二和第三部分之间制作切口点。
                       21. 抓住底层肌肉,从神经质上提升。
                       22. 轻轻地用力通过粘膜将小血小气囊进入腔腔。
                       23. 用眼睑缩回器(或任何适当的材料)缩回眼缩切口( 图12C)。
                       24. 对于完整的卵巢切除术,通过电烧或激光二极管烧灼周围血管( 图12D)。
                       25. 使用单丝缝合线,关闭切口与中断,不断缝合模式。

                       直接处理、目视观察和形态测量提供了非侵入性技术,是确定女性生殖阶段的首要评估标准。然而,这项研究表明,肉体卵巢并不总是通过触觉可靠地识别。根据物种的不同,重力卵巢有时可以通过动物腹侧半透明( 图13A,B) 或完全半透明的皮肤进行目视检测( 图13C)。 完成排卵的女性与肉体女性相比,其外观可能有明显变化(例如,皮肤松弛,身体质量损失高达30%, 图13D)。 在繁殖过程中,雄性和雌性将表现出某些行为,这些行为提供有关接近排卵和排卵的信息。 在R.muscosa 的情况下,表明女性接近排卵开始与女性进入手架。

                       超声波技术在阿努兰和考斯的影响下应用,可以诊断卵子是否存在,以及排卵是否与发育的卵子的完全或部分释放有关。因此,这种方法提供了更完整和准确的生殖状态评估,而不局限于通过可视化技术确定肉体/非肉体状态,这种可视化技术因腹部皮肤透明度或表皮一致性而变化。不同的两栖动物物种。超声波可以相对容易地进行,对动物几乎没有压力( 图5 和 图13), 并可用于描述生殖周期和确定生殖状态4。 ^{熟悉物种至关重要;然而,这项研究 显示,Necturus 和R.Muscosa 在其生殖模式中有着共同的发育迹象,允许对生殖阶段进行类似的分类( 图5)。 通过这项技术,现在有证据表明,在圈养 的Necturus 和R.Muscosa 中,卵子发育高度,而且这两种物种都遵循季节性模式。虽然这些现象的原因不明,需要进一步调查,如果不使用超声波,卵巢功能障碍的几个领域,如卵子保留和部分排卵,将不被发现。今后应用这项技术将用来确定是否应选择雌性在任何特定年份繁殖,以及是否完成排卵。}

                       血液收集协议,如 在R.Muscosa 中提出的,它既有效,对动物造成最小的痛苦,是研究圈养和野生捕获的阿努兰人(Calatayud,未发表的)激素的最佳状态。迄今为止,没有关于 圈养R.Mussa 的年度激素概况的信息,因此,没有关于激素如何影响其健康和繁殖的知识。此外,随着证据表明,该物种的雌性可能不是年度育种者,荷尔蒙分析将是跟踪卵巢周期的另一种方法。与超声波一起, 激素分析可能导致更好的预测什么女性将准备排卵.此外,在过去一年里,有两例圈养 的R.Mussa 种群的两例性间病例记录在案。此外,拇指垫的发展已经注意到一些较老的创始女性。原因目前正在调查之中,但初步结果显示,这可能与睾丸激素水平的变化(卡拉塔尤德,未发表)。不同年龄的女性的荷尔蒙周期将帮助我们理解为什么女性可能发展男性相关的继发性特征,以及这是否是预期在老龄化人群中。

                       外源激素疗法已用于克服在圈养两栖动物中经常遇到的生殖功能障碍。然而,在这项研究中, 对于R.mussa 和Necturus 种群,分别在2年和5年的时间里,在激素治疗和对照女性之间的排卵位没有显著差异。这可能表明激素给药协议, 剂量, 启动和激素组合使用是不够的物种.对个体女性生殖史的更仔细 分析表明,R.Mussa 可能没有每年繁殖,这也可能导致治疗女性缺乏荷尔蒙效应。因为每年有一定比例的雌性不断跳过繁殖,了解该物种的自然历史有助于确定是否需要外源性激素以及何时可能最有效。本文中概述的程序可适用于若干物种( 表1), 适用于5g至150g的阿努兰;较大的动物可能需要不同的注射器和针片。注射的位置因一些需要肌肉内、腹内、下皮或内皮注射的激素而异( 图7)。

                       以卵巢切除术为目的的手术是各种两栖动物获取卵母细胞用于胚胎学研究的常用方法。卵子切除术也可能用于人口控制和医疗问题,如卵子保留。在部分卵巢切除术的情况下,为研究目的进行卵母细胞收获,手术必须确保动物保持繁殖。PGF ₂₊ 的管理在解决 女性R.Muscosa 的卵子保留方面显示出一些希望。在几个个体中,PGF ₂₌ 导致先前保留的卵子完全沉积,但在其他个体中,只有部分沉积需要手动剥离才能去除所有卵子。虽然PGF ₂₊ 可以替代 在R.Mussa 中保留卵子的手术,但其治疗其他两栖动物类似病理条件的能力需要特定物种的验证。当手术干预被授权给阿努兰或考达病人时,有必要在切口之前确保适当的麻醉平面。需要敏锐的观察技能来评估和监测本研究对每个分类的规范诱导和恢复反应。一旦熟悉特定的解剖学,适当的手术方法,血相变,温和的组织操作和适当的术后管理,生殖手术不会构成压倒性的障碍。

                       GE logiq Book XP and 8C-RS probe 4e10 MHz GE Medical Systems	GE medical systems	GE logiq Book XP	Ultrasound
                       Aloka 500 7.5mHz linear or IBEX multi-frequency (10-6mHz) micro-convex	GE medical systems	8C-RS (10 MHz)	Ultrasound probe
                       BD disposable U-100 insulin syringe (28-29 G needle)	Mettler Electronics Corp CA	Sonigel	Ultrasound gel (water soluble, salt-free)
                       <strong>Hormone</strong>
                       Gonadotropin releasing hormone	BACHEM	4012028	<strong>synonym:</strong> [Des-Gly10, D-Ala6, Pro-NHEt9]-GnRH acetate<br/> <strong>abbreviation:</strong> GnRH
                       Lutenizing hormone releasing hormone	BACHEM, Sigma-Aldrich	4033013;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; L1898	<strong>synonym:</strong> Pyr-His-Trp-Ser-Tyr-Gly-Leu-Arg-Pro-Gly-NH<sub>2</sub> acetate salt;<br/> [D-Ala6}-LHRH acetate salt hydrate<br/> <strong>abbreviation:</strong> LHRH
                       Human chorionic gonadotropin	BACHEM, Sigma-Aldrich	4030270, 4018894; C1063, CG5, CG10	<strong>synonym:</strong> Chorionic gonadotropin-&beta; (109-145)(109-119); Choriogonin, HCG (2,500IU, 5,000IU, 10,000IU)<br/> <strong>abbreviation:</strong> hCG
                       Prostaglandin 2&alpha;	Sigma-Aldrich	P40424;	<strong>synonym:</strong> (5Z,9&alpha;,11&alpha;,13E,15S)-9,11,15-Trihydroxyprosta-5,13-dienoic acid tris salt, PGF2&alpha;&minus;Tris;<br/> <strong>abbreviation:</strong> PGF2&alpha;
                       Follicle-stimulating hormone	Sigma-Aldrich	F4021, F8174	<strong>synonym:</strong> porcine, sheep<br/> <strong>abbreviation:</strong> FSH
                       Progesterone	Sigma-Aldrich	46665;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; P7556	<strong>synonym:</strong> Vetranal; P4 water soluble<br/> <strong>abbreviation:</strong> P4
                       Pituitary extract	na		<strong>synonym:</strong> Check papers for amphibian species derivation<br/> <strong>abbreviation:</strong> PE
                       Pregnant Mare Serum Gonadotropin	Prospec;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp;&nbsp; Lee Biosolutions; Sigma-Aldrich	HOR-272;&nbsp;&nbsp;&nbsp; 493-10; 9002-70-4	<strong>synonym:</strong> Pregnant Mare Serum Gonadotropin<br/> <strong>abbreviation:</strong> PMSG
                       Metaclopromide	Sigma-Aldrich	M0763	<strong>synonym:</strong> 4-Amino-5-chloro-N-[2-(diethylamino)ethyl]-2-methoxybenzamide, Methoxychloroprocainamide<br/> <strong>abbreviation:</strong> MET
                       Lucrin	BACHEM; Sigma-Aldrich	4033014;&nbsp;&nbsp; L0399	<strong>synonym:</strong> Leuprorelin acetate<br/> <strong>abbreviation:</strong> Lucrin
                       Lutalyse	Pfizer		<strong>synonym:</strong> PGF2&alpha; – Dinoprost tromethamine<br/> <strong>abbreviation:</strong> Lut
                       Pimozide	Sigma-Aldrich	P1793	<strong>synonym:</strong> 1-[1-[4,4-bis(4-Fluorophenyl)butyl]-4-piperidinyl]-1,3-dihydro-2H-benzimidazol-2-one<br/> <strong>abbreviation:</strong> PZ
                       Amphiplex	see above		<strong>synonym:</strong> Gonadotropin releasing hormone + metoclopramide<br/> <strong>abbreviation:</strong> GnRH + MET
                       Ovopel	Ovopel	na	<strong>synonym:</strong> GnRHa + dopamine receptor antagonist (administered 1 pellet/ kg)<br/> <strong>abbreviation:</strong> Ovo
                       Ovaprim	Pentair aquatic eco-systems	Ova10	<strong>synonym:</strong> Salmon gonadotropin + domperidone<br/> <strong>abbreviation:</strong> Ova
                       Domperidone	Sigma-Aldrich	D122	<strong>synonym:</strong> 4-(5-Chloro-2-oxo-1-benzimidazolinyl)-1-[3-(2-oxobenzimidazolinyl)propyl]piperidine<br/> <strong>abbreviation:</strong> DOM

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