于和伟在读初中时喜欢唱歌，在校期间，学习一般的他第一年中考成绩并不理想。因为不想做待业青年，决定补习一年再考。于和伟两次中考后，成绩还是不理想，恰好当时抚顺市幼儿师范学校第一年招男生，毕业后可以去小学当音乐老师。在补习班老师的建议下，进了抚顺幼儿师范学校学音乐。毕业后，因为爱好文艺，后来考进了抚顺话剧团。

1992年，于和伟考入了上海戏剧学院 ^。

2023年3月25日，于和伟参演的《三体》获得2022微博年度剧集。 ^[140] 1996年，他在上海戏剧学院出演了个人首部话剧《借我一个男高音》。

1997年，于和伟去了南京军区前线话剧团 ^。

1999年，参演个人首部电视剧《 曹操 》，从而正式进入演艺圈。

2000年，出演都市情感剧《 深圳女人 》。

2002年，出演 苏舟 执导的反腐剧《 省委书记 》；同年，出演都市喜剧《 王记大排档 》，在剧中饰演王记排挡的厨师西瓜 ^。

2003年，在 高希希 执导的抗战剧《 历史的天空 》中饰演任军分区副政委万古碑 ^{；同年，出演近代传奇剧《 大宅门2 》，在剧中饰演白景琦孙子白占安 。}

2004年，于和伟与 李雪健 、 殷桃 联袂主演情感伦理剧《 搭错车 》，在剧中饰演阿美的亲生父亲苏民生；12月20日，其参演的抗战剧《 追日 》播出，在剧中饰演日本人木村一郎；同年，出演抗战剧《 敌后武工队 》。

2006年10月12日，与 侯勇 、 丁志诚 、 殷桃 等人合作主演的都市情感剧《 真情年代 》在中国中央电视台电视剧频道播出，于和伟在剧中饰演循规蹈矩的知识分子李和平 ^{；12月，出演 严敏求 、 许亚军 联袂主演的家庭伦理剧《 孝子 》播出，他在剧中饰演乔水兰的丈夫沈致公 ；12月13日，于和伟与 许晴 、 殷桃 、 王伯昭 等人共同出演的都市商战剧《 局中局 》播出，于和伟在剧中饰演赵天宇的孪生哥哥周英文 。}

2007年，出演 高希希 执导的伦理情感剧《 男人底线 》，在剧中饰演阴冷顽固的赵通达 ^{；之后，于和伟在 吴君如 主演的爱情喜剧《 我爱芙蓉姐 》中饰演广告公司总经理常青；4月6日，其参演的抗战剧《 霓虹灯下的哨兵 》播出，在剧中饰演前线文工团演员郝铁蛋 ；同年，在 郑方南 执导的军旅爱情剧《 战地浪漫曲 》中饰演心肠好的唐副司令。}

2008年11月22日，主演 高希希 执导的年代情感剧《 纸醉金迷 》，他在剧中饰演的投机倒把的奸商范宝华 ^{；11月23日，与 马伊琍 合作主演的都市情感剧《 锁春记 》播出，于和伟在剧中饰演商界精英庄世博 ；11月25日，主演的情感剧《 漂亮的事 》在中央电视台电视剧频道播出，他在剧中饰演国有企业的副厂长江百川 ；12月4日，出演的都市悬疑剧《 面具 》播出，他在剧中饰演身价数千万，业内翘楚的著名精神心理学博士常思远 ；此外，他还出演了年代革命剧《 光荣岁月 》；同年，主演刑侦剧《 华容道 》，在剧中饰演南华的老板郭林。}

2009年6月，凭借电视剧《 纸醉金迷 》入围 第15届上海电视节白玉兰奖 最佳男演员奖 ^。

2010年5月2日，与 陈建斌 、 陆毅 、 倪大红 合作主演的古装剧《 三国 》播出，在剧中饰演三国时期蜀汉开国皇帝刘备 ^{；7月11日，与 胡军 、 梅婷 合作出演的都市情感剧《 岁月 》在北京卫视播出，他在剧中饰演性格善良的现代机关干部吴过 ；9月6日，主演的年代战争剧《 家仇 》在东方卫视播出，于和伟在剧中饰演个性冷静凶残多变、老谋深算的军阀张天心 ；9月20日，与 侯勇 、 唐文龙 联袂主演的抗战剧《 特战先锋 》播出，他在剧中饰演军统局二号人物毛人凤 ；10月20日，其参演的近代革命剧《 冰是睡着的水 》播出，他在剧中饰演敌对组织的特工周新宇 ；12月，与 林永健 、 何赛飞 共同主演的都市情感剧《 老马家的幸福往事 》播出，他在剧中饰演的莫文辉，为了不再过无家可归的生活，他放弃自己心爱的女人马拉，又用一生为了爱情赎罪 ；随后，与 罗海琼 搭档主演的都市情感剧《 幸福在路上 》，于和伟在剧中饰演相貌英俊、性格豪爽的军区参谋马刚 。}

2011年，凭借电视剧《幸福在路上》获得南方盛典最佳男演员奖 ^{；3月18日，主演的年代谍战剧《 青盲 》播出，他在剧中饰演有勇有谋、代号“青盲”的共产党王牌特工张海峰 ；5月16日，与 谷智鑫 、 李沁 、 徐百慧 等人合作主演的近代革命剧《 中国1921 》播出，他在剧中饰演任北京大学文科学长的 陈独秀 ；10月19日，主演的谍战剧《 兵临城下 》上星播出，于和伟在剧中饰演的杨少诚，想扛枪打仗的热血青年，因祖业岌岌可危，被逼无奈扛起了振兴家业的重托 。}

2012年2月29日，其作为嘉宾参加的娱乐访谈节目《 非常静距离 》播出 ^{；5月22日，获得MSN星月年度最具价值男演员奖；6月10日，与 佟瑞欣 、 赵恒煊 、 海顿 等人合作主演的谍战剧《 奸细 》在山东电视台影视频道播出，他在剧中饰演军统关州总负责人江一平 ；6月25日，主演的都市情感剧《 男人的战争 》播出，在剧中饰演冶金大院三兄弟之首唐季山 ；10月1日，其参演的军旅剧《 我是特种兵之利刃出鞘 》播出，于和伟在剧中饰演铁拳团团长康雷 ；10月22日，与 王丽坤 合作主演的抗战剧《 连环套 》播出，他在剧中饰演中共地下党孟庆凡 ；11月7日，与 刘威葳 、 刘钧 联袂主演的家庭情感剧《 大家庭 》在中央电视台综合频道播出，于和伟在剧中饰演的袁刚，诚恳仗义，是70年代末拖家带口的回城知青 ；12月28日，参演的古装武侠剧《 楚汉传奇 》播出，于和伟在剧中饰演中国第一代皇帝秦始皇。}

2013年2月4日，于和伟与 杨童舒 、 李依晓 、 霍青 等人共同主演的家庭伦理剧《 天下人家 》播出，他在剧中饰演入殓师唐中秋 ^{；12月15日，与 王丽坤 搭档主演的抗战剧《 零下三十八度 》在东方卫视上星播出，于和伟在剧中饰演诈死隐居的国民党特工年定邦 。}

2014年4月28日，与 王丽坤 合作主演的都市时尚情感剧《 爱的多米诺 》播出，他在剧中饰演玩具设计师戴谷顺 ^{；8月14日，于和伟与 刘涛 、 邵汶 联袂主演的都市情感剧《 下一站婚姻 》播出，他在剧中饰演转业特种兵龚箭 ，其后，他凭借该剧获得了 第17届华鼎奖 当代题材最佳男演员奖 ；同年，他还主演了刑侦剧《 刑警队长 》，于和伟在剧中饰演的刑警队长顾铭，不仅率领队友屡破大案保卫城市安全，还是一位爱妻儿孝顺父母的好男人 。}

2015年1月，与 刘欢 、 叶璇 联袂主演抗战剧《 搜索连 》，在剧中饰演师长吴休葆 ^{；4月15日，于和伟与 何晟铭 、 白冰 联袂主演的都市情感剧《 婚前协议 》上星播出，他在剧中饰演时装设计公司董事长高寒 ；5月25日，与 祖峰 、 叶一云 、 张延 合作主演的刑侦剧《 刑警队长 》，于和伟在剧中饰演的顾铭，既是智勇双全、刚柔并济的“人民卫士”，也是一位拥有着敏锐洞察力、坚忍耐力、执着信念的刑警队长 ；9月，与 侯梦莎 、 黄梦莹 、 金美伶 等人合作出演的现代青春励志剧《 警花与警犬 》开机，于和伟在剧中饰演的杜飞，在刑侦工作岗位上勇于担当，明察秋毫，具备良好的职业素质和过硬的侦查能力 ；随后，他还出演了贺岁片《 过年好 》 ；12月23日，作为嘉宾出席了 第30届中国电视剧飞天奖 典礼 ；12月24日，与 冯小刚 、 张涵予 、 许晴 合作出演的剧情片《 老炮儿 》上映，于和伟在片中饰演温柔中带着霸气的龚叔 。}

2016年1月15日，与 黄渤 、 孙红雷 、 黄磊 等人合作主演的喜剧片《 极限挑战 》上映，他在片中饰演明朝皇帝永历帝 ^{；3月，主演古装权谋剧《 大军师司马懿之军师联盟 》，在剧中饰演进可金戈铁马，退可赋诗歌怀的枭雄曹操 ；5月15日，与 朱雨辰 、 李小冉 共同出演的年代谍战剧《 追击者 》播出，于和伟在剧中饰演军统特工曹若飞 ；7月22日，其出演的悬疑片《 魔都凶音 》上映，他在片中饰演史总 ；11月18日，与 范冰冰 、 郭涛 合作主演的剧情片《 我不是潘金莲 》上映 [116] ，饰演新任县长郑重 ；同年，主演都市情感轻喜剧《 下一站，别离 》，在剧中饰演成熟稳重、低调务实的公司高管秋阳 2017年，于和伟担纲艺术总监并领衔主演刑侦缉毒剧《 猎毒人 》，在剧中饰演滨江市飞鹏生物化学科技研究室创始人吕云鹏 ；7月27日，其出演的革命史诗片《 建军大业 》上映，于和伟在片中饰演时任中共中央总书记 陈独秀 ；9月16日，凭借电影《我不是潘金莲》获得 第31届中国电影金鸡奖 最佳男配角 ；11月28日，其参加录制的阅读推广季播节目《 见字如面第二季 》在黑龙江卫视播出 ；12月，于和伟凭借其主演的电视剧《大军师司马懿之军师联盟》获得 第8届澳门国际电视节 最佳男配角提名 ，以及中国年度新锐榜年度艺人 。}

2018年，凭借电视剧《 大军师司马懿之军师联盟 》获得第24届上海电视节举行“白玉兰奖”最佳男配角 ^{；4月16日，为电视剧《下一站，别离》演唱的插曲《 青春告别诗 》正式上线；4月28日，其参演的犯罪悬疑片《 幕后玩家 》上映 ；之后，凭借电视剧《刑警队长》、《大军师司马懿之军师联盟》入围 第31届中国电视剧飞天奖 优秀男演员奖 ；6月，以飞行嘉宾身份参加了湖南卫视生活服务纪实节目《 向往的生活第二季 》 ；7月15日，其作为飞行嘉宾参加的励志体验真人秀节目《 极限挑战第四季 》在东方卫视播出 ；7月20日，其参演的现代探险剧《 沙海 》在腾讯视频播出，他在剧中饰演吴邪的三叔吴三省 ；8月10日，其参演的电影《 一出好戏 》上映 ；9月，其作为飞行导师参加的演技竞演类励志综艺节目《 我就是演员 》播出 ；10月14日，凭借电视剧《大军师司马懿之军师联盟》入围中国电视金鹰奖观众喜爱的男演员奖 。}

2019年3月5日，获得电视剧品质盛典活动年度实力演技剧星 ^{；4月8日，其特约主演的古装神话剧《 封神演义 》播出，于和伟在剧中饰演周朝开国丞相姜子牙 ；9月7日，获得第十七届电影表演艺术学会奖 ；12月31日，主演的爱情喜剧片《 宠爱 》上映，在片中饰演高铭 。}

2020年，与 雷佳音 、 张国立 、 周冬雨 主演了动作片《 坚如磐石 》，在剧中饰演富商黎志田 ^{；10月1日，参演的电影《 我和我的家乡 》上映，片中饰演姜伟岸 。11月26日，参演的献礼剧《 大决战 》开机，将在剧中饰演 林彪 ，该剧于次年3月16日杀青 ；12月13日，主演的检察剧《 巡回检察组 》播出 [113] ，在剧中饰演东川省巡回检察组组长冯森 。}

2021年1月9日，与 章子怡 、 周一围 搭档主演古装历史剧《 上阳赋 》，在剧中饰演王儇的父亲王蔺 ^{；2月1日，与 张桐 、 侯京健 主演的近代革命剧《 觉醒年代 》播出，在剧中饰演 陈独秀 ；2月12日，与 雷佳音 、 杨幂 、 董子健 合作主演的悬疑片《 刺杀小说家 》上映 ；4月30日，主演的谍战题材电影《 悬崖之上 》上 映 [114] ，于和伟在片中饰演潜伏敌人内部多年的特工周乙 [103] ； 6月25日，参演的《 大决战 》开播 [107] ；7月1日，参加的 庆祝中国共产党成立100周年 文艺演出《 伟大征程 》播出，与 张桐 、 刘烨 、 白宇 、 邓伦 、 宋轶 、 杨洋 、 李现 、 杨紫 合作表演《破晓》 [108-109] ；8月12日，于和伟在播出的《 理想之城 》里饰演赵显坤 [100] [110] 。10月，成龙电影A计划第五期公布了创投项目评审团及拍摄工作坊导师团阵容，于和伟加盟创投评审团 [117] ；10月15日，于和伟加盟原创喜剧竞演综艺《 一年一度喜剧大赛 》，担任嘉宾 [118] 。}

2022年1月，主演的电视剧《 我是刑警 》在哈尔滨杀青，饰演秦川 ^[124] ；9月23日，参加的原创喜剧竞演综艺《 一年一度喜剧大赛 第二季 》播出，并担任组委会会长 ^[128] [135] ；11月1日消息，加盟《金钥匙创投计划》。 ^[129] 11月6日，参加第14届金鹰节颁奖晚会。 ^[131] 11月29日，于和伟上线新歌《 只字不提 》。 ^[134]

2023年 1月15日，领衔主演的科幻剧《 三体 》播出，在剧中饰演刑警史强 ^[120] [136] 。1月28日，于和伟在微博发文透露自己获评国家一级演员 ^[137] 。3月，参演的《城中之城》在上海举行了开机仪式，在剧中饰演赵辉 ^[142] ；3月30日，获得《 剧耀东方·2023电视剧品质盛典 》品质榜样剧 星 ^[143] 。1991年，于和伟与 宋林静 相恋。1996年，两人同时毕业，并被同时招进了南京军区前线话剧团 ^。

于和伟不工作的时候，喜欢看电影、看书，并且会去享受旅行，到一个没去过的地方 ^{。2015年1月，参与爱心公益接力，呼吁大家传递文明新风 ；9月，赴四川大凉山实地探访当地缺水状况，带领探访队员们进行高海拔“无水挑战”、为缺水家庭背水，并在微博上实时分享感悟，号召大家节约用水，为山区的同胞们伸出援助之手 ；12月29日，参与“母亲水窖爱聚15年”公益晚会，并被授予“母亲水窖宣传大使”称号 。}

2016年1月21日，获得第五届中国公益节年度公益人物奖 ^{；7月，于和伟在辽宁省抚顺市捐建了两座蒲公英儿童图书馆 ；其后，9月6日，于和伟助阵公益直播，发起了一次以爱心捐助为主题的“吃”直播，将直播中的所有收益均悉数捐赠给大山里的留守儿童与贫困儿童，为他们能吃上“免费午饭”献出一份爱心 。}

2021年12月29日，当选中国电视艺术家协会演员工作委员会副会长。 ^[123] 。他演技精湛，虽然小鼻子小眼睛的，却让人有种很信任的感觉 ^{。在一组写真中，于和伟以白色衬衫、黑色领结及黑色西服的男人味装扮尽显其时尚气质，还透露出一丝单纯的呆萌耍怪，充分展现了他独有的魅力 。 （王丽坤、搜狐娱乐、南方网评）}

在电视剧《三国》中他充分演出了君王刘备稳重和睿智的特点 。他的荧屏形象丰富而出彩，无论出演的是主角或是配角、正派还是反派、古装抑或现代，都让观众看到了他演技更多的精彩一面 。在电视剧《搜索连》中，他饰演的角色打破了以往脸谱化的军人形象，既彰显了军人硬汉气质的帅气一面，性格中也不乏风流不羁，偶尔还会冒出点小幽默。这种形象在神经紧绷的抗战戏中体现了难得的喜剧效果，同时，也让人物形象更加立体真实 。 （高希希、新浪娱乐、搜狐娱乐评）