Abstract
Objective
To explore the expression, localization and regulatory effect on mitochondrial calcium signaling of Rictor in embryonic stem cell-derived cardiomyocytes (ESC-CMs).
Methods
Classical embryonic stem cell cardiomyogenesis model was used for differentiation of mouse embryonic stem cells into cardiomyocytes. The location of Rictor in ESC-CMs was investigated by immunofluorescence and Western blot. The expression of Rictor in mouse embryonic stem cells was interfered with lentiviral technology, then the superposition of mitochondria and endoplasmic reticulum (ER) in ESC-CMs was detected with immunofluorescence method; the cellular ultrastructure of ESC-CMs was observed by transmission electron microscope; the mitochondrial calcium transients of ESC-CMs was detected by living cell workstation; immunoprecipitation was used to detect the interaction between 1, 5, 5-trisphosphate receptor (IP3 receptor, IP3R), glucose-regulated protein 75 (Grp75) and voltage-dependent anion channel 1 (VDAC1) in mitochondrial outer membrane; the expression of mitochondrial fusion protein (mitonusin-2, Mfn2) was detected by Western blot.
Results
Rictor was mainly localized in the endoplasmic reticulum and mitochondrial-endoplasmic reticulum membrane (MAM) in ESC-CMs. Immunofluorescence results showed that Rictor was highly overlapped with ER and mitochondria in ESC-CMs. After mitochondrial and ER were labeled with Mito-Tracker Red and ER-Tracker Green, it was demonstrated that the mitochondria of the myocardial cells in the Rictor group were scattered, and the superimposition rate of mitochondria and ER was lower than that of the negative control group (
P
< 0.01). The MAM structures were decreased in ESC-CMs after knockdown of Rictor. The results of the living cell workstation showed that the amplitude of mitochondrial calcium transients by ATP stimulation in ESC-CMs was decreased after knockdown of Rictor (
P
< 0.01). The results of co-immunoprecipitation showed that the interaction between IP3R, Grp75 and VDAC1 in the MAM structure of the cardiomyocytes in the Rictor group was significantly attenuated (
P
< 0.01); the results of Western blot showed that the expression of Mfn2 protein was significantly decreased (
P
< 0.01).
Conclusion
Using lentiviral technology to interfere Rictor expression in mouse embryonic stem cells, the release of calcium from the endoplasmic reticulum to mitochondria in ESC-CMs decreases, which may be affected by reducing the interaction of IP3R, Grp75, VDAC1 and decreasing the expression of Mfn2, leading to the damage of MAM structure.
Keywords:
Embryonic stem cells/cytology, Myocytes, cardiac/cytology, Mammalian target of rapamycin, Calcium signaling, Endoplasmic reticulum, Mitochondrial
哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin，mTOR)是一种进化上高度保守的丝/苏氨酸蛋白激酶，属于磷脂酰肌醇激酶(phosphatidylinositol kinase，PI3K)相关激酶蛋白家族成员
。mTOR在细胞的生长代谢中起重要作用，其在细胞内可形成两种蛋白复合体，即mTORC1和mTORC2。目前国内外研究主要集中于mTORC1，而对mTORC2在各种生理/病理状态下(包括心脏发育/心脏疾病等)的功能和调控知之甚少。mTORC2主要由Rictor、mTOR、GbL和SIN1组成，其中Rictor是定义mTORC2的关键蛋白
。研究发现，mTORC2可使下游Akt、PKC等蛋白磷酸化，参与细胞骨架蛋白构建、细胞迁移，以及心肌肥大、心肌缺血损伤时的心肌保护等
。因此，深入了解Rictor/mTORC2信号通路在心脏生理、病理发生和发展中的作用，可能可以为研究心肌分化发育和心脏疾病的防治提供新的思路。
有研究报道，mTORC2在小鼠胚胎成纤维(mouse embryonic fibroblast, MEF)细胞中定位于内质网和线粒体-内质网结构偶联(mitochondria-associated endoplasmic reticulum membrane，MAM)域，mTORC2缺失可破坏该偶联结构
。MAM主要通过线粒体融合蛋白(mitofusin，Mfn)、葡萄糖调节蛋白75(glucose regulated protein 75，Grp75)起连接作用，其中Grp75与内质网上的1, 4, 5-三磷酸肌醇受体(IP3 receptor，IP3R)和线粒体外膜的电压依赖性阴离子通道(voltage-dependent anion channel 1，VDAC1)相互偶联形成复合物
。MAM存在高钙微区，钙可以从内质网通过此通道传递到线粒体。遗传编码的双功能接头分别锚定在线粒体和内质网上，通过雷帕霉素诱导连接内质网和线粒体的双功能接头，形成MAM，提高钙在MAM中的转运效率。MAM中钙穿梭可为线粒体膜蛋白提供局部高浓度钙，从而使其与钙结合并发挥功能
。在哺乳动物中线粒体Mfn有Mfn1和Mfn2两种分子，它们共同调控线粒体的融合，其中Mfn1在线粒体融合前期促进线粒体间相互融合，而Mfn2主要在线粒体融合后期发挥作用
。近年越来越多的研究发现，在多种细胞系中，连接内质网和线粒体的重要分子是Mfn2，而不是Mfn1
胚胎干细胞是一种来源于囊胚期内细胞团，可自我更新和分化为生物体内各种类型细胞的全能干细胞。体外胚胎干细胞向功能性心肌细胞模型的定向分化可应用于心脏发育生理学、心脏病理学、心脏疾病再生治疗和新药研发等领域
，但心肌细胞分化是一个复杂的过程，其调控机制目前尚未完全阐明。有研究表明，体外胚胎干细胞分化为心肌细胞的过程中细胞内质网钙释放增加
。钙离子作为心肌细胞的第二信使，可影响MEF2和GATA-4等转录因子的活动，进而调控参与心肌细胞形成和分化相关基因的表达
。在胚胎干细胞分化为心肌细胞的过程中，线粒体能量代谢从厌氧糖酵解形式转变为氧化磷酸化形式，以产生更多能量用于分化和满足跳动心肌细胞的兴奋收缩偶联。线粒体内一定浓度钙可促进ATP合成
。前期研究发现，干扰Rictor/mTORC2可抑制胚胎干细胞定向分化为心肌细胞，且可导致分化后心肌细胞肌小节排列不规则、电生理功能紊乱等现象
，但关于Rictor/mTORC2在小鼠胚胎干细胞定向分化而来的心肌细胞中的表达定位及其对线粒体钙信号的调控作用尚不明确。
本研究主要利用小鼠胚胎干细胞来源的心肌细胞(embryonic stem cell-derived cardiomyocytes，ESC-CM)模型，探索Rictor/mTORC2定位表达对MAM结构及功能的影响，旨在揭示Rictor对ESC-CM模型MAM结构中内质网和线粒体间钙穿梭的调控作用，阐明Rictor/mTORC2在小鼠胚胎干细胞定向分化为心肌细胞过程中的作用机制。
1 材料与方法
1.1 材料、试剂和仪器
小鼠ES-D3细胞系购自美国模式培养物集存库。6~8周性成熟的雌性和雄性ICR小鼠由浙江大学动物实验中心提供，动物生产许可证为SCXK(浙)20080033，动物使用及相关处理严格参照浙江大学实验动物管理办法执行。Accutase酶、小鼠白血病抑制因子为美国Millipore公司产品；Rhod-2AM染料、脂肪酸辅酶A连接酶长链4(FACL4)、电压依赖性阴离子通道蛋白1(VDAC1)、Mfn2抗体为英国Abcam公司产品；内质网绿色荧光探针、线粒体红色荧光探针、F-127、内质网靶向绿色荧光蛋白(ER-GFP)为美国Life Technology公司产品；线粒体绿色荧光探针、细胞线粒体分离试剂盒、ATP含量测试盒、抗荧光淬灭封片剂、IP裂解液为上海碧云天生物技术有限公司产品；胰蛋白酶、ATP为美国Sigma公司产品；丝裂霉素C、青霉素、链霉素为浙江海正药业股份有限公司产品；DMSO、Triton X-100、β-巯基乙醇(β-ME)、吐温20(Tween-20)为北京索莱宝科技有限公司产品；PMSF、抑蛋白酶多肽、亮抑蛋白酶肽、丙烯酰胺、双丙烯酰胺、甘氨酸、Tris、多聚甲醛为生工生物工程(上海)股份有限公司产品；Lowery蛋白定量法试剂为美国Bio-Rad公司产品；EZ-ECL化学发光增强试剂盒为以色列Biological Industries公司产品；Rictor、IP3R抗体为美国Santa Cruz公司产品；Grp75抗体为美国Cell Signaling Technology公司产品；a-Actinin、GAPDH、β-Tubulin抗体为美国Sigma-Aldrich公司产品。
荧光倒置显微镜(DMIL3000B)、EMUC7型超薄切片机为德国Leica公司产品；显微镜(CKX31)、活细胞工作站、FV3000激光共聚焦显微镜为日本Olympus公司产品；高速离心机(5702)为德国Eppendorf公司产品；蛋白质电泳、电转移装置为北京六一仪器厂产品；台式酶标仪(DTx880型)、流式细胞仪、落地式超速离心机、高速冷冻离心机为美国Beckman Coulter公司产品；H-7650型透射电镜为日本Hitachi公司产品。
1.2 原代MEF细胞及饲养层细胞制备
将性成熟雌鼠(6~8周龄)与雄鼠(8周龄)按2:1合笼。将妊娠13.5 d的ICR小鼠脱颈处死，用无菌手术剪刀和镊子取出胎鼠，置于含无菌D-Hank's的培养皿中。去除胎鼠的头部、内脏、四肢及尾巴后，将躯干部分置于另一含无菌D-Hank's的培养皿中，洗2~3次。用无菌小剪刀剪碎，加入0.25%胰蛋白酶，在37 ℃水浴锅上消化5 min，反复多次。离心收集细胞，以一定密度加至含10%小牛血清的培养皿中，此时记为P0代。传代至P3~P5时，加入终浓度为0.5 mg/mL的丝裂霉素C，置于孵箱孵育1~2 h，弃去培养液，D-Hank's清洗后加入0.25%胰蛋白酶液消化，离心后接种，贴壁后即可作为饲养层细胞使用。
1.3 小鼠胚胎干细胞支持培养
取出冻存在液氮中的小鼠胚胎干细胞，于37 ℃温水中迅速解冻，待完全溶化后加入含6 mL培养液的离心管中，离心后加入1 mL胚胎干细胞培养液(高糖DMEM培养液，含1%非必需氨基酸、10
6
U/L小鼠白血病抑制因子、10%FBS)重悬细胞，接种到铺有饲养层细胞的培养瓶中，细胞长成合适大小的克隆时即可传代。
1.4 建立ESC-CM模型
将胚胎干细胞用1 mL 0.25%胰蛋白酶溶液与等体积1×D-Hank's进行消化计数，加入悬滴培养液(高糖DMEM培养液，含1%非必需氨基酸、20%FBS)，配成细胞密度为3×10
4
个/mL的单细胞悬液，以30 L/滴接种于细菌培养皿(培养皿底部加入适量无菌水)的盖子内表面上，使盖子内的液滴倒挂成悬滴，置于5%二氧化碳、37 ℃孵箱中培养3 d。
悬滴培养3 d后，可形成球形拟胚体，用移液枪转移拟胚体至铺有1%琼脂的培养皿中，加入总体积为10 mL的悬浮细胞培养液(高糖DMEM培养液，含1%非必需氨基酸、15% FBS)，悬浮培养2 d。
将悬浮培养2 d后的拟胚体用移液枪转移至六孔板中，每孔约80个拟胚体，每孔加入3 mL贴壁细胞培养液(高糖DMEM培养液，含10%新生FBS、1%非必需氨基酸)，贴壁第1天记D 5，贴壁后第n天记为D 5+n，在D 5+3进行收样或其他检测。
1.5 流式细胞术检测ESC-CM纯化率
取D 5+3贴壁生长的拟胚体，在显微镜下用无菌手术刀切下跳动的区域，收集细胞，4 ℃下100×
g
离心4 min，1×D-Hank's清洗，即得纯化后的心肌细胞
，并采用流式细胞术进行ESC-CM纯化率检测。
1.6 短发夹RNA (shRNA)-Rictor慢病毒表达载体构建并转染小鼠胚胎干细胞
根据参考文献[
21
]设计shRNA-Rictor干扰靶点，委托上海吉玛制药技术有限公司进行慢病毒的构建和包装。干扰序列为shRNA-Control：TTCTCCGAACGTGTCACGTTC，shRNA-Rictor：GCC AGTAAGATGGGAATCATT。
5
个胚胎干细胞接种于12孔板，贴壁4 h后以感染复数(MOI)为50进行慢病毒转染。转染时加入终浓度为5 g/mL的聚凝胺，孵箱中培养24 h，然后将转染的细胞种在饲养层上进行增殖，待其长成适宜大小的克隆后即可制备悬滴，进行心肌分化培养。
1.7 免疫荧光法检测小鼠ESC-CM中Rictor定位及MAM结构
用Accutase酶消化D 5+3的ESC-CM，以3×10
4
/孔的密度种于48孔板中，培养1 d后，除去上清液，用1×D-Hank's清洗后，加入ER-GFP进行转染，第二天用1×D-Hank's清洗，加入线粒体红色荧光探针。检测MAM结构时，同时加入线粒体红色荧光探针和内质网绿色荧光探针，置于37 ℃孵育30 min后用1×PBS清洗，4%多聚甲醛室温固定30 min，1×PBS洗3次，3% BSA在室温摇床上封闭1 h，加入稀释的Rictor一抗，4 ℃冰箱摇床过夜。第二天，1×PBS洗3次，加入稀释后的荧光二抗(染料Dylight 650)，4 ℃冰箱避光孵育2 h，1×PBS洗3次后，用防猝灭剂封片，激光共聚焦显微镜观察。
1.8 透射电镜技术检测ESC-CM的线粒体和MAM
收集D 5+3的ESC-CM，用PBS清洗，然后用2.5%戊二醛在4 ℃冰箱固定过夜。第二天，100×
g
离心5 min，除去上清固定液，加入热琼脂进行包埋，将样本切成3~4份，用酸碱度值为7.0的0.1 mol/L磷酸缓冲液洗3次，1%饿酸固定1.5 h。再用酸碱度值为7.0的0.1 mol/L磷酸缓冲液洗3次，然后用30%、50%、70%、80%、90%和95%浓度梯度的乙醇各进行脱水处理15 min，无水乙醇处理20 min，最后用纯丙酮处理20 min。将包埋剂与丙酮等体积混合处理样本1 h，吸掉包埋剂，将包埋剂与丙酮按3:1的体积混合并处理样本3 h，最后用纯包埋剂处理样本置于室温过夜。第二天，将样本取出后再用纯包埋剂包埋起来，70 ℃加热过夜。用EMUC7型超薄切片机切片，再用柠檬酸铅溶液和醋酸双氧铀50%乙醇饱和溶液各染色5~10 min，即可用H-7650型透射电镜观察。
1.9 蛋白质印迹法检测Rictor等蛋白表达
1.9.1 细胞总蛋白提取
收集D 5+3的纯化心肌细胞样本置于冰上，用1×PBS清洗，加入适量全裂解液(裂解液中加入0.1 mg/mL PMSF，10 g/mL抑蛋白酶多肽，10 g/mL亮抑蛋白酶肽)，在冰上反复吹打30 min，取上清液，用Lowry法测定蛋白浓度，定量分装，加入上样缓冲液，95 ℃、5 min变性，冷却后置于-80 ℃冰箱保存。
1.9.2 细胞器蛋白提取
取D 5+3的纯化心肌样本，1×PBS洗2次，4 ℃下600×
g
离心5 min。加入20 mL预冷的IBcells-1(225 mmol/L甘露醇，75 mmol/L蔗糖，0.1 mmol/L EGTA和30 mmol/L Tris-HCl，酸碱度值为7.4)重悬，用预冷的研磨杵均化25次，4 ℃下600×
g
离心5 min。收集上清液，4 ℃下7000×
g
离心10 min，沉淀为含有线粒体的混合物，上清液是含有溶酶体和微粒的细胞质，收集用于后续内质网的提取。沉淀加入20 mL IBcells-2(225 mmol/L甘露醇、75 mmol/L蔗糖和30 mmol/L Tris-HCl，酸碱度值为7.4)重悬，4 ℃下7000×
g
离心10 min，重复操作一次，其中离心力改为10 000×
g
，上清液为粗线粒体，用预冷的线粒体重悬缓冲液重悬，取出0.2 mL用于后续研究。剩余的粗线粒体溶液加8 mL低密度梯度分离液和3.5 mL线粒体重悬缓冲液溶液进行分离，4 ℃下95 000×
g
离心30 min，离心后可见分层，中间白色带是MAM结构，管底为纯线粒体层。MAM层用线粒体重悬缓冲液稀释10倍，4 ℃下6300×
g
离心10 min，取上清液，4 ℃下100 000×
g
离心1 h，沉淀即为MAM结构，用线粒体重悬缓冲液重悬。上一层纯线粒体层用线粒体重悬缓冲液稀释10倍，4 ℃下6300×
g
离心10 min，再用20 mL线粒体重悬缓冲液重悬，4 ℃下6300×
g
离心10 min，沉淀即为纯线粒体，线粒体重悬缓冲液重悬后用于后续实验。上述所得含溶酶体和微粒的细胞质在4 ℃下20 000×
g
离心30 min，取上清液，4 ℃下100 000×
g
离心1 h，沉淀即为纯内质网，上清液为细胞质，沉淀用线粒体重悬缓冲液重悬，用于后续实验。
1.9.3 蛋白质印迹法检测Rictor等蛋白表达
取20 g蛋白样本加至SDS-PAGE中1.5~2 h；用转膜装置将蛋白转至硝酸纤维素膜上；用5%的脱脂牛奶封闭1 h；剪切所需蛋白位置，用稀释的Rictor、IP3R、Grp75、α-actinin、GAPDH、β-tubulin、FACL4、VDAC1、Mfn2一抗孵育(稀释比例根据抗体说明书确定，GAPDH及β-Tubulin为内参蛋白)，4 ℃冰箱摇床过夜。第二天用1×TPBS洗3次，加入HRP标记的相应二抗(1:5000比例稀释)，室温摇床孵育1 h，用1×TPBS洗3次，采用电化学发光法检测印迹膜，在暗室内压片。ImageJ软件分析条带。
1.10 活细胞工作站检测小鼠ESC-CM线粒体钙瞬变
用Accutase酶消化D 5+3的ESC-CM，以1×10
4
/孔的密度种于96孔板中，37 ℃孵箱培养2 d后，进行线粒体钙瞬变测定。检测当天用1×PBS洗1次，负载Rhod-2AM染料，37 ℃孵箱孵育45 min。之后用1×PBS洗3次，加入含血清的培养液复性，在激发波长为494 nm、发射波长为516 nm下观察细胞荧光强度变化即为线粒体钙浓度变化。上机前用清洗缓冲液洗1次，加入15 μL清洗缓冲液上机调基线，待基线平稳后再加入15 μL ATP(400 μmol/L)。
1.11 免疫共沉淀法检测小鼠ESC-CM中IP3R-Grp75-VDAC1蛋白的相互作用
收集D 5+3的ESC-CM，1×PBS清洗后，加入IP细胞裂解液，4 ℃下13 000×
g
离心30 min。取相同蛋白，补加IP裂解液至500 μL，剩余蛋白直接用蛋白质印迹法检测其表达情况。加入一抗，4 ℃冰箱摇床过夜；第二天加入蛋白A/G琼脂，4 ℃冰箱摇床上孵育3 h，结束后用1×PBS洗5次，4 ℃下600×
g
离心去上清液，加入上样缓冲液，95 ℃变性5 min，冷却后置于-80 ℃冰箱保存。
1.12 统计学方法
采用SPSS 10.0软件进行统计学分析。所有实验至少重复3次。计量资料以均数±标准差(
s
)表示，组间比较采用方差分析，
P
＜0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 ESC-CM纯化率
纯化后心肌细胞α-actinin阳性率为(82.1±2.7)%，说明本研究方法纯化率较高。
2.2 Rictor在小鼠ESC-CM中的表达及定位
免疫荧光检测结果显示，Rictor与线粒体及内质网共叠加区域呈粉红色，叠加程度高(
)，提示Rictor可能定位于ESC-CM的MAM结构中。提取纯化ESC-CM各细胞器蛋白，用蛋白质印迹法确认Rictor的定位表达情况。结果显示，Rictor在粗提线粒体、MAM、内质网和细胞质中均有表达，但在纯线粒体中并无表达(
)，提示Rictor可能位于MAM、内质网和细胞质中。
2.3 干扰Rictor对ESC-CM中MAM结构的影响
采用慢病毒技术干扰胚胎干细胞的Rictor表达后，共聚焦显微镜观察线粒体与内质网的叠加情况，结果如
所示：干扰组心肌细胞线粒体呈散点状，线粒体和内质网叠加率为0.65±0.01，较对照组(0.80±0.07)降低(
P
＜0.01)，提示干扰Rictor表达后，ESC-CM中MAM结构减少。随后采用透射电镜进一步考察干扰Rictor对分化后心肌细胞MAM结构数量的影响，结果显示对照组中MAM结构较多，而干扰组MAM结构减少(
)，说明干扰Rictor可导致MAM结构形成减少。
2.4 干扰Rictor对ESC-CM中线粒体钙瞬变的影响
加入400 μmol/L ATP后，干扰组ESC-CM线粒体钙瞬变斜率(1.238±0.010)和上升峰值(1.126±0.003)较对照组(分别为1.721±0.033和1.538±0.011)降低(均
P
<0.01，
、
)，提示干扰Rictor可以抑制ESC-CM中由IP3R介导的内质网钙释放到线粒体。
2.5 Rictor调控ESC-CM中MAM结构钙穿梭分子机制
蛋白质印迹法检测结果显示，干扰Rictor表达后，ESC-CM中Mfn2的相对表达量为0.788±0.22，较对照组(表达量设为1)降低，差异有统计学意义(
P
＜0.01)，见
。免疫共沉淀结果显示，与阴性对照组比较，干扰组IP3R、Grp75、VDAC1相互作用明显降低(
)。结果提示，干扰Rictor后可通过减少Mfn2蛋白表达以及IP3R-Grp75-VDAC1复合物形成，破坏MAM偶联结构。
3 讨论
胚胎干细胞体外定向分化为功能性心肌细胞模型可以模拟体内心肌细胞发育过程，从而获取心肌细胞发育依赖性的生物信息，并且避免了剖杀胎鼠、培养时间短、难以获得足够的心肌细胞数量、容易产生不同批次间差异等弊端，目前已应用于心脏发育生理学、心脏病理学等领域
在胚胎发育过程中，心脏是第一个形成并发挥功能的器官。心肌细胞对于能量需求很高，依赖ATP激发兴奋收缩偶联过程。在胚胎干细胞分化为心肌细胞过程中，钙信号也作为一个重要的调控因素。钙不仅是氧化磷酸化产生ATP的一个关键调节因子，通过刺激三羧酸循环限速酶以及增加电子传递链中辅酶可用性来调节氧化磷酸化，而且还参与调节心肌细胞形成与分化相关的转录因子
mTORC2在胚胎和胚外组织的发育中发挥重要调节作用。人羊水干细胞拟胚体的形成依赖于mTORC1和mTORC2活性
。其中mTORC2复合物的稳定性和完整性依赖于核心蛋白Rictor和哺乳动物应激激活的蛋白激酶相互作用蛋白1。敲除Rictor的胚胎在阴道见栓后的第9.5天出现生长阻滞，第13.5天死亡，且胎盘发育有缺陷，敲除胚胎心脏组织中的Rictor，大约胚胎第12天引起心脏缺陷和胚胎致死；然而小鼠出生后，敲除Rictor对于小鼠心脏生长和功能几乎没有影响
。本研究所采用的小鼠ESC-CM模型为仍处于胚胎发育阶段的心肌细胞模型，类似于未成熟的胚胎/胎儿心肌细胞，与成体心肌细胞在结构和功能上有些差异
。有研究表明，Rictor在MEF细胞中定位于内质网和MAM结构，而MAM结构可形成一个高钙区域，钙通过IP3R-Grp75-VDAC1复合物从内质网释放到线粒体。本研究通过免疫荧光法和蛋白质印迹法发现Rictor主要在MAM结构中表达，与文献报道一致。干扰Rictor表达后，ESC-CM的MAM中IP3R、Grp75和VDAC1之间的相互作用明显减弱；免疫荧光检测结果显示线粒体和内质网的叠加率下降；透射电镜观察到MAM结构的形成减少；同时由ATP刺激的线粒体钙瞬变也降低。这些结果提示在ESC-CM中干扰Rictor蛋白表达后，MAM结构受到破坏，内质网和线粒体间的钙穿梭减少。
Mfn1和Mfn2具有很高的同源性，共同调控了线粒体外膜融合，参与调控许多细胞生理功能，如细胞增殖、凋亡以及氧化还原等
。越来越多的研究证明，Mfn2独立于Mfn1发挥连接内质网与线粒体的作用。在MEF和Hela细胞中，抑制Mfn2的表达会引起线粒体和内质网的相互作用减弱，从而影响线粒体钙摄取的效率；而抑制Mfn1的表达没有此效应
。在心肌细胞中，连接肌浆网与线粒体的重要组成是Mfn2，而不是Mfn1；同时Mfn2也是线粒体摄取从肌浆网中释放钙的重要功能蛋白。由Mfn2连接的心肌细胞肌浆网-线粒体形成高钙微区，满足心肌细胞快速调节线粒体生物能量活性以适应瞬时代谢的需求
。本研究通过慢病毒干扰技术干扰胚胎干细胞中Rictor的表达，结果发现ESC-CM中Mfn2表达明显下降，提示心肌细胞肌浆网和线粒体间的物理连接可能有所减少，这也可能是导致内质网释放到线粒体的钙减少的原因之一。
基于上述研究结果，我们推测干扰Rictor表达后可能通过影响IP3R-Grp75-VDAC1复合物的形成，降低Mfn2表达，破坏MAM结构，减少线粒体钙摄取，影响ATP合成，最终抑制胚胎干细胞定向分化为心肌细胞。这将有利于更深入理解Rictor/mTORC2在心肌发育中的生理作用，为探究心肌分化诱导剂的作用新靶点提供依据，也可为诱导性多潜能干细胞应用研究提供借鉴。
