2.1. 星形胶质细胞

星形胶质细胞（astrocyte, AST）是CNS中除神经元外最为丰富的细胞。AST在受到刺激情况便可激活，形态上变得肥大，并伴随着AST活化特异性标志胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein, GFAP）表达增高。AST具有支持神经细胞、营养神经组织、维持CNS稳态、构成血脑屏障等功能，并能在神经系统受到损伤后起到修复作用。作为CNS微环境最为重要的组分，AST在肿瘤脑转移病灶形成中起到重要的作用 ^{[ 43 ]} 。

AST活化后可分泌多种细胞因子影响肿瘤细胞的增殖、侵袭、转移能力。有研究发现AST可通过分泌基质金属蛋白酶2（matrix metalloprotein 2, MMP2）及MMP9，清除肿瘤细胞表面及周围基质成分，促进肿瘤细胞的侵袭及转移能力 ^{[ 44 ]} ，MMP是调节肿瘤微环境最为重要的蛋白酶之一，除了发挥蛋白酶的降解基质、促进侵袭功能之外，MMP2及MMP9可通过激活转化生长因子-β（transforming growth factor-β, TGF-β）调控细胞生长，通过VEGF调节血管生成等功能 ^{[ 45 ]} ，相关的临床资料 ^{[ 46 ]} 也表明MMP2表达阳性的脑原位或转移肿瘤的患者的生存期更短。在黑色素瘤脑转移的研究中发现，AST可在黑色素瘤细胞刺激下产生白介素3（interleukin-3, IL-3）、CD40L、CXCL12及IFN-γ等多种细胞因子，其中IL-23则刺激肿瘤细胞产生MMP-2，从而促进肿瘤细胞增殖 ^{[ 41 ]} 。肿瘤细胞与AST通过细胞因子网络相互作用机制是非常复杂的，有研究表明，CNS中的肿瘤细胞可分泌巨噬细胞迁移抑制因子（macrophage migration inhibitory factor, MIF）、IL-8及纤溶酶原激活物抑制因子1（plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1）激活AST，激活的AST又可分泌IL-6、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α, TNF-α）及IL-1β促进肿瘤细胞的增长，但IL-6R表达却有所下调 ^{[ 47 ]} ，这与Sierra的结果 ^{[ 48 ]} 有部分差异。然而，AST除促进肿瘤细胞生长之外，也有研究证实AST对部分的肿瘤细胞的生长可起到抑制作用，主要机制在于CNS中的纤溶酶使得AST细胞膜上的FasL脱落形成分泌型的FasL引发肿瘤细胞凋亡 ^{[ 29 ]} 。

最新的一项研究 ^{[ 49 ]} 表明，AST产生外泌体与肿瘤细胞融合后，外泌体内含的的miRNA（主要是miR-19a）可使得肿瘤细胞发生PTEN低表达丢失，进一步活化PI3K/AKT/mTOR通路，促使肿瘤细胞分泌趋化因子2（chemokine ligand 2, CCL2），募集IBA-1表达的髓性细胞，从而促使肿瘤增殖，这一过程特异地发生在CNS中，肿瘤细胞与肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast, CAF）共培养并未出现此现象。这项发现意义在于可以很好地解释脑转移细胞往往都会出现特异性的PTEN的低表达，从而引起PI3K/AKT/mTOR信号通路过度活化这一现象 ^{[ 8 , 16 , 49 , 50 ]} 。外泌体是细胞外直径约40 nm-100 nm的小囊泡，可由肿瘤细胞、神经细胞、淋巴细胞及肿瘤细胞等细胞产生，广泛存在于多种组织间液中，其囊泡内含有蛋白质、miRNA、mRNA、脂质等多种细胞成分，作为细胞外的膜性结构可参与细胞之间信号传递，在肿瘤血管形成、转移等过程中起到了重要作用 ^{[ 51 , 52 ]} 。外泌体及其内涵物可以作为肿瘤细胞与其微环境相互作用的途径，进而影响肿瘤细胞的生长，这一发现为脑转移病灶提供一个新颖的治疗靶点，引发了众多关注，外泌体及微囊泡也成为近期肿瘤领域研究热点之一 ^{[ 53 , 54 ]} 。

AST还具有保护肿瘤细胞免受化疗药物细胞毒作用的功能。这种保护机制可能是基于AST与肿瘤细胞的直接接触及间隙连接通信（gap joint communication, GJC）起作用的，但成纤维细胞却不能起到类似的作用 ^{[ 55 , 56 ]} 。AST与黑色素细胞瘤细胞接触后，细胞间的接合素43（connexin 43）的GJC作用可使黑色素瘤细胞免于化疗药物诱导的细胞凋亡 ^{[ 55 ]} 。此外，AST与肿瘤细胞的直接接触可促使肿瘤细胞分泌IL-6及IL-8，使得AST产生内皮素1（endothelin 1, ET1），ET1与肿瘤细胞的内皮素受体（endothelin receptor, ETR）结合之后可激活AKT及MAPK通路影响下游BCL2L1、TWIST1及GSTA5表达使得细胞免受化疗药物的影响 ^{[ 56 - 58 ]} 。类似的，Murphy等 ^{[ 59 ]} 则在发现connexin 43可通过活化AKT/AMPK/mTOR信号通路诱导恶性胶质瘤对替莫唑胺耐药。但也有研究 ^{[ 60 ]} 表明，睾丸癌细胞之间却能通过connexin 43之间的信号通路增强化疗药物的细胞毒作用，推测GJC可以传递某些小分子物质诱导肿瘤细胞凋亡。由此可见，肿瘤细胞与微环境、肿瘤细胞与肿瘤细胞之间特定的GJC信号分子可以影响肿瘤细胞在CNS等微环境下对化疗敏感程度，阻断或活化GJC之间的信号传导，对于增强化疗药物效果可能有一定的临床意义。

AST作为微环境的一个关键因素，可与肿瘤细胞相互作用后通过分泌细胞因子网络、直接接触及外泌体等多种途径影响脑转移的肿瘤细胞生物学行为，两者之间作用网络复杂，部分机制尚未完全明确，需得到进一步的阐释 ^{[ 53 , 59 ]} 。

2.2. 小胶质细胞/巨噬细胞

正常的CNS缺乏淋巴细胞、巨噬细胞等常见的免疫细胞及相应的淋巴管道，小胶质细胞在CNS免疫反应中扮演了重要的角色。小胶质细胞属于单核-巨噬细胞系统，激活后甚至难以从形态学及分子标志上来和循环中的巨噬细胞相区分，而异种共生的动物实验表明，转移瘤模型中的小胶质细胞/巨噬细胞多来源于循环中的单核巨噬细胞，颅内原有的小胶质细胞仅占少数 ^{[ 61 ]} 。因此，有部分文献将CNS中激活的小胶质细胞直接称之为小胶质细胞/巨噬细胞 ^{[ 62 , 63 ]} 。

免疫系统在肿瘤发生与发展中有着重要的地位。肿瘤中的巨噬细胞主要可分成两型，即M1及M2型，其中M2型单核巨噬细胞表面抗原为CD163及CD204，通过分泌Arginase、IL-10、脂多糖（lipopolysaccharide, LPS）、干扰素γ（interferon-γ, IFN-γ）及转化生长因子-β1（transforming growth factor-β1, TGF-β1）等细胞因子促进肿瘤生长，而M1型则高表达诱导型一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase, iNOS），并分泌IL-1、IL-12、NO、TNF-α，具有杀伤肿瘤细胞作用 ^{[ 63 , 64 ]} 。Wei等 ^{[ 63 ]} 回顾了小胶质细胞/巨噬细胞在胶质瘤中的作用，小胶质细胞/巨噬细胞在其中的作用倾向于M2表型，并可与胶质瘤细胞相互作用，促进胶质瘤细胞侵袭及血管生成，但其抑瘤作用仅表现在协同CD8 ⁺ T细胞、ADCC及少量的M1表型的细胞毒作用这几个方面。小胶质细胞/巨噬细胞作为CNS中免疫功能最为重要的一环，明确脑转移肿瘤中小胶质细胞/巨噬细胞分化类型及其产生机制对明确CNS中免疫系统与肿瘤细胞之间关系有着重要的意义。

体外研究表明，LPS可激活小胶质细胞，促使其向M1型分化，并分泌NO及TNF-α等细胞因子杀伤肿瘤细胞 ^{[ 61 , 65 ]} ，然而，低浓度的小胶质细胞培养上清液却具有促肿瘤生长作用 ^{[ 65 ]} ，实际上，在肺癌脑转移的病理组织中，尽管肿瘤及周围高表达iNOS，但TNF-α表达量却较低，围绕肿瘤组织的主要是一层厚的IBA-1阳性小胶质细胞/巨噬细胞，这表明在脑转移病灶的不同部位，小胶质细胞有着不同的分化及功能 ^{[ 65 ]} ，这一功能的差异取决于小胶质细胞/巨噬细胞本身受到微环境的刺激 ^{[ 63 ]} 。除了典型的M1及M2分化之外，有研究发现乳腺癌细胞刺激下的小胶质细胞可通过非经典的Wnt通路活化通路，促进乳腺癌细胞侵袭及生长 ^{[ 66 ]} 。证据还来自于Rietkötter等 ^{[ 67 ]} 的实验，他们发现不同于外周血中的单核/巨噬细胞，小胶质细胞促进肿瘤生长、侵袭作用并不依赖CSF-1的激活作用。

小胶质细胞/巨噬细胞在脑转移病灶中表型变化及相关机制仍有较多空白，以小胶质细胞/巨噬细胞为靶点在治疗肿瘤中远没有当下热门的免疫治疗取得的成果明显。虽有体外实验表明用唑来膦酸可促使CNS中小胶质细胞/巨噬细胞发生表型变化发挥抑制肿瘤侵袭作用 ^{[ 68 ]} ，同时也有临床资料证明唑来膦酸可以减少乳腺癌患者复发风险 ^{[ 69 ]} ，但对于肿瘤脑转移患者目前尚缺乏相关足够的临床证据，需要通过进一步的临床试验证实拮抗小胶质细胞/巨噬细胞治疗肿瘤脑转移的效果。

2.3. 脑转移瘤微血管

肿瘤生长离不开充足的血供，微血管在肿瘤细胞转移机制及生长方面起到重要的作用。脑转移动物模型病理结果显示肿瘤细胞多分布在微血管的周围75 μm左右，距离微血管100 μm的肿瘤细胞多无法生存，Kienast等 ^{[ 70 ]} 通过荧光示踪法追溯脑转移模型中所有肿瘤细胞的命运，结果发现与血管分离的肿瘤细胞无一例外都走向死亡，Fidler等 ^{[ 43 , 71 ]} 还发现脑转移肿瘤微血管具有平均血管密度（mean vessel density, MVD）低，但管腔多异常扩张不完整的特点。

VEGF是血管形成的关键因子，早前的实验 ^{[ 72 ]} 已经证明了在脑转移病灶形成过程中，VEGF是必要而非充分的因素。且有研究 ^{[ 73 ]} 表明脑转移病灶VEGF水平较原发灶高，且与微血管密度（microvessel density, MVD）成正相关。除促血管生成之外，VEGF还可以激活脑转移过程中一部分休眠的细胞，促使其增殖形成微转移灶 ^{[ 70 ]} 。回顾性分析 ^{[ 74 , 75 ]} 表明使用贝伐珠单抗可以有效地降低肺癌患者脑转移病灶的形成，且并不增高CNS出血风险。然而需要引起注意的是血管形成还受其他因子调控，肺癌脑转移动物实验表明，尽管通过抑制VEGFR可以拮抗VEGF塑造血管的能力，但由于碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor, bFGF）的高表达，肿瘤负荷并没有减轻 ^{[ 71 ]} 。

2.4. BBB

BBB是肿瘤细胞形成脑转移病灶首先接触的一个结构，由毛细血管内皮细胞及之间的紧密连接、基膜、AST的树突构成。生理情况下，BBB具有维持CNS稳态的功能，对药物、毒素、离子等物质具有隔离作用。BBB完整性的维持关键是BBB的紧密连接，其紧密连接由跨膜蛋白及周围蛋白构成，跨膜蛋白由封闭蛋白（occludin）、联接黏附分子（junctional adhesion molecules, JAMs）及紧密连接蛋白claudin（BBB上主要为claudin-5）组成，构成细胞之间的相互连接；周围蛋白则分布在紧密连接的两侧，包括闭锁小带（zonula occluden, ZO）及丝状肌动蛋白结合蛋白（afadin）等蛋白，可维持BBB稳定性 ^{[ 76 ]} 。动物实验 ^{[ 71 , 77 ]} 表明，多种肿瘤细胞株均能顺利通过BBB，且发现直径大于0.25 mm的肿瘤脑转移病灶内部的BBB的完整性受到了不同程度的破坏。肿瘤细胞穿过BBB之间是形成脑转移病灶的第一步，但目前具体机制尚未完全明确。既往Bos等 ^{[ 78 ]} 通过比较脑转移病灶与原细胞基因表达差异筛选发现环氧合酶（cyclooxygenase-2, COX2）、α2, 6-唾液酸转移酶（α2, 6-sialyltransferase, ST6GALNAC5）及EGF可介导乳腺癌细胞穿过BBB，并推测ST6GALNAC5可以通过促使内皮细胞表面唾液酸化而特异性地介导了脑转移，在结肠癌的患者中，ST6GALNAC5的rs1736858的SNP与脑转移风险高度相关 ^{[ 79 ]} 。而肿瘤细胞产生的COX2则可以诱导产生前列腺素，从而促进肿瘤细胞高表达MMP1，降解BBB上的Claudin及ZO-1 ^{[ 80 ]} 。但Lee等 ^{[ 81 ]} 则认为COX2主要来源并非肿瘤细胞，而为BBB的内皮细胞。神经肽物质P（neuropeptide substance, SP）也可通过改变ZO-1及claudin-5的分布及位置促使肿瘤细胞穿过BBB。体外研究则表明，小细胞肺癌细胞可分泌胎盘生长因子（placental growth factor, PLGF）与VEGFR-1受体结合后，活化ROCK-ERK1/2通路，促使occludin磷酸化而改变BBB的紧密连接，最终易化小细胞肺癌细胞穿过BBB ^{[ 82 ]} 。

细胞分泌的囊泡内容物也可介导肿瘤细胞破坏BBB。有研究 ^{[ 83 ]} 表明，乳腺癌细胞能够直接通过外泌体中的miRNA-105下调紧密连接中的ZO-1破坏BBB的完整性，促使肿瘤细胞向颅内转移，但也有研究则表明BBB的破坏并不仅仅在于紧密连接中的ZO-1蛋白，Tominaga等发现，乳腺癌细胞能分泌的小囊泡（extracellular vesicles, EV），大小约100 nm，包括外泌体及其他的囊泡）中可特定的被BBB内皮细胞摄取，EV中的miRNA181c可抑制BBB内皮细胞上的磷酸肌醇依赖性蛋白激酶1（3-phosphoinositide-dependent protein kinase-1, PDPK1）的表达，而PDPK1下调可使肌动蛋白素（cofilin）磷酸化水平下降并激活cofilin，从而引起肌动蛋白（actin）构象改变，破坏了BBB的紧密连接，促使乳腺癌细胞穿过BBB ^{[ 84 ]} 。考虑到肿瘤细胞穿过BBB机制的多样性及其脆弱性，BBB或许并不能作为一个好的抵抗肿瘤入侵CNS及治疗的靶点。此外，既往肿瘤细胞穿透BBB的机制研究主要集中在乳腺癌中，而关于肺癌的研究相对较少，各种肿瘤细胞是否存在不同的机制值得进一步探讨。

而BBB另一成分血管内皮细胞在与CNS转移的肿瘤细胞相互作用主要表现在肿瘤转移过程中的细胞间粘附，在NSCLC细胞脑转移的早期，肿瘤细胞能与内皮细胞通过VLA-4/VCAM-1、ALCAM/ALCAM及LFA-1/ICAM-1粘附，而这些早期粘附分子可作为预防脑转移形成的靶点 ^{[ 85 ]} 。而另有研究 ^{[ 86 ]} 则表明脑转移肿瘤NSCLC细胞高表达CD15，并与TNF-α激活的内皮细胞CD62E相互作用，介导肿瘤细胞粘附微血管。此外，肿瘤细胞与内皮细胞相互作用还可促进肿瘤侵袭及肿瘤血管生成，即肿瘤细胞JAK-STAT通路激活后可分泌VEGF，与VEGFR2结合后激活血管内皮的JAK-STAT通路，MMP-9分泌增多，增强肿瘤细胞的侵袭能力 ^{[ 87 ]} 。

BBB更重要的一点在于它是影响药物治疗脑转移病灶主要的因素。BBB上的内皮细胞丰富表达p-糖蛋白（p-glycoprotein, p-gp）、乳腺癌耐药蛋白（breast cancer resistance protein, BCRP）等ATP结合转运蛋白[ATP-binding cassette (ABC) efflux transporters, ABCG]，ABCG是一类依赖ATP的分子转运体，能将其底物逆浓度梯度转运。目前常用的化疗或靶向药物大多是ABCG家族中某一个或几个的蛋白作用底物，造成CNS病灶药物常常难以达到有效的治疗浓度 ^{[ 2 ]} 。以靶向药物厄洛替尼为例，在p-gp及BCRP敲除的小鼠中脑组织AUC可达（49.6±3.95）μg/g∙h，而野生型的小鼠脑组织AUC仅仅为（11.0±1.35）μg/g∙h，远低于血浆的（80.2±3.5）μg/g∙h ^{[ 88 ]} 。为突破BBB的限制，可采用联合放疗、增大药物剂量及使用ABCG抑制剂等方式，提高药物在CNS中的分布情况以达到良好的治疗效果 ^{[ 2 ]} 。

2.5. 脑转移转移瘤微环境的其他细胞成分

其他细胞成分如少突胶质细胞、循环的免疫细胞及CNS间质成分与肿瘤细胞相互作用研究较少。有研究 ^{[ 89 , 90 ]} 表明，将NK细胞种植到乳腺癌或胶质瘤动物模型中，可抑制胶质瘤细胞及HER阳性的乳腺癌细胞生长，但在动物乳腺癌脑转移模型中却发现CD11b阳性的髓样细胞聚集并形成早期肿瘤转移的“土壤”，进一步释放炎症因子S100A8及S100A9，诱导肿瘤细胞趋化 ^{[ 91 ]} 。甚至在人肿瘤CNS中可见肿瘤相关成纤维细胞（cancer associated fibroblast, CAF），进一步的研究 ^{[ 92 ]} 表明CAF可促进肿瘤细胞侵袭。

脑转移肿瘤细胞生物学特性的变化及肿瘤细胞与其微环境相互作用可能可以解释肿瘤细胞这颗“种子”如何在颅内“土壤”中定植、生长这一相对低效的转移过程 ^{[ 93 ]} ，然而，颅脑微环境在脑转移病灶中的肿瘤细胞生物学行为改变中扮演了“筛选”还是“诱导”的角色尚不明确。有研究将肺癌、黑色素瘤与星形胶质细胞共培养后检测全基因组甲基化水平，同样部分复制出脑转移动物模型中甲基化情况的改变，提示星形胶质细胞可以使肿瘤细胞发生甲基化水平变化 ^{[ 9 ]} 。而McDermott R则提出这样一种模式，星形胶质细胞、小胶质细胞等CNS微环境组分与肿瘤细胞相互作用下可产生某些细胞因子，从而改变肿瘤细胞的miRNA水平，进而影响相应靶基因的表达 ^{[ 94 ]} 。

总之，恶性肿瘤脑转移问题一直是肿瘤医生关注的热点问题。“种子-土壤”模型的提出为解决脑转移病灶生长提供了一个大的框架。肿瘤细胞与星形胶质细胞、小胶质细胞、微血管、血脑屏障等结构相互作用及肿瘤细胞在中枢神经系统产生的适应性变化，有助于我们发现新的治疗靶点。