2. 结果

2.1. ASMSCs与HDMSCs具有相同的形态、表型和增殖能力

在显微镜下，HDMSCs与ASMSCs均为长梭形贴壁生长的细胞。HDMSCs与ASMSCs均持续表达CD29、CD44和CD105，但不表达CD14、CD45和HLA-DR。在1~7 d的培养过程中，HDMSCs与ASMSCs增殖能力无明显差异（ 图 1 ）。

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图 1

ASMSCs与HDMSCs具有相同的形态、表型和增殖能力

ASMSCs and HDMSCs have identical morphology, phenotype and proliferation rate. A : Both HDMSCs and ASMSCs are plastic-adherent, spindle-shaped cells. B : The cells express CD29, CD44, and CD105 but not CD14, CD45, or HLA-DR. C : HDMSCs and ASMSCs have similar proliferation rate when cultured in DMEM with 10% FBS for 1-7 days.

2.2. TNF-α诱导下，ASMSCs自噬水平低于HDMSCs TNF-α诱导6 h后，ASMSCs中LC3 II/LC3 I的蛋

白表达水平明显低于HDMSCs，而P62的表达水平明显高于HDMSCs（ 图 2 ）。进一步通过荧光显微镜观察，我们发现自噬诱导后ASMSCs的GFP-LC3B荧光斑点明显弱于HDMSCs（ 图 2 ）。

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图 2

TNF-α诱导下，ASMSCs自噬水平低于HDMSCs

ASMSCs show decreased autophagy after treatment with TNF-α. ASMSCs have a lower LC3 II/LC3 I protein expression ratio but a higher P62 protein expression than HDMSCs. Fluorescence microscopy further reveals a significantly weaker and more diffuse GFP-LC3 puncta staining in ASMSCs than in HDMSCs. * P < 0.05.

2.3. ASMSCs自噬过程中PI3K/AKT/mTOR信号通道异常激活

尽管自噬过程中ASMSCs与HDMSCs的PI3K、AKT及mTOR基因表达水平无明显差异（ 图 3A ），但ASMSCs的p-PI3K/PI3K、p-AKT/AKT及p-mTOR/ mTOR蛋白表达水平明显高于HDMSCs（ 图 3B ）。

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图 3

ASMSCs自噬过程中PI3K/AKT/mTOR信号通道异常激活

The PI3K/Akt-mTOR signaling pathway is hyperactivated in ASMSCs during TNF-α-induced autophagy. A : Expressions of PI3K, AKT and mTOR mRNA are comparable between HDMSCs and ASMSCs. B : Protein expressions of p-PI3K/PI3K, p-AKT/ AKT and p-mTOR/mTOR are significantly higher in ASMSCs than in HDMSCs. * P < 0.05.

2.4. 阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路可恢复ASMSCs自噬水平

400 nmol/L的TG100713可有效阻断PI3K的磷酸化（ 图 4A ）。阻断PI3K磷酸化后，ASMSCs中p-AKT/ AKT、p-mTOR/mTOR、LC3 II/LC3 I及P62的表达恢复至HDMSCs水平，而GFP- LC3B荧光斑点强度也与HDMSCs相当（ 图 4B ）。

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图 4

阻断PI3K/AKT/mTOR信号通路可将ASMSCs自噬水平恢复至HDMSCs的水平

Blocking PI3K/AKT/mTOR signaling pathway eliminates the difference in autophagy between ASMSCs and HDMSCs. A : TG100713 (400 nmol/L) effectively eliminates the difference in p-PI3K/PI3K expression. B : TG100713 eliminates the differences in the puncta staining (GFP-LC3B) and protein expressions (p-AKT/AKT, p-mTOR/mTOR, LC3 II/LC3 I and P62) between HDMSCs and ASMSCs. * P < 0.05 vs healthy donors.

3. 讨论

TNF-α是一种多功能细胞因子，广泛参与体内的病理生理过程，如：增殖、分化、凋亡、自噬等 ^{[ 14 ]} 。研究表明，TNF-α与AS的发病密切相关。首先，TNF-α在-238，-308，-850，-1031和rs769178位点上的基因多态性与AS的易感性密切相关 ^{[ 15 ]} ；其次，AS患者血清及骶髂关节中TNF-α水平明显升高 ^{[ 16 , 17 ]} ，且血清中TNF-α水平与AS疾病活动度成正相关 ^{[ 18 ]} ；此外，TNF-α抑制剂可有效治疗AS ^{[ 19 ]} 。但是，TNF-α参与AS发病的具体机制尚未完全明确。最近多项研究进一步指出，TNF-α可通过调控MSC的功能参与AS的发生发展。TNF-α介导ELMO1的m6A甲基化修饰可诱导AS患者MSC定向迁移 ^{[ 20 ]} ；TNF-α可通过自噬调控MSC凋亡，影响MSC的免疫调节能力 ^{[ 21 ]} 。我们前期研究表明，激活自噬可提高MSC的抑炎能力，反之亦然 ^{[ 22 ]} 。因此，我们推测TNF-α可能通过调控MSC自噬参与AS的发病。

细胞自噬与内环境稳态密切相关，自噬水平异常可诱发炎症反应并参与自身免疫性疾病的发病 ^{[ 10 ]} 。B细胞自噬增多而T细胞自噬减少与系统性红斑狼疮体内慢性炎症密切相关 ^{[ 23 , 24 ]} ；滑膜成纤维细胞自噬增多及成骨细胞/破骨细胞自噬失调参与了类风湿性关节炎的发生发展 ^{[ 25 ]} ；肌成纤维细胞自噬水平下降是系统性硬化症的重要发病机制 ^{[ 26 ]} 。在本研究中，我们发现TNF-α诱导下ASMSCs的自噬水平明显低于HDMSCs。ASMSCs自噬水平下降可导致其抑炎能力降低、体内炎症水平升高，这可能是AS慢性炎症的发病机制之一。

细胞自噬是一个复杂的病理生理过程，多种细胞因子及信号通路参与其中，PI3K/AKT/mTOR信号通路是其中最重要的调控通路之一 ^{[ 27 , 28 ]} 。PI3K/AKT/mTOR信号通路激活后，既可直接抑制自噬，又可通过调控P70S6K、AMBRA1、ULK1和BECLIN1等因子的表达抑制自噬小体的形成，负向调控细胞自噬 ^{[ 29 , 30 ]} 。本研究结果显示，在ASMSCs自噬过程中，PI3K/AKT/mTOR表达明显升高；抑制PI3K磷酸化后，AKT及mTOR的表达及ASMSCs自噬均恢复至HDMSCs水平。说明PI3K/AKT/mTOR信号通路异常激活是导致ASMSCs自噬减弱的关键机制。

本研究中，我们发现TNF-α诱导下，PI3K/AKT/ mTOR信号通路异常激活是导致ASMSCs自噬减弱的关键。ASMSCs自噬减弱可导致其抑炎能力下降并诱发或加重AS患者体内慢性炎症。但是，PI3K/AKT/ mTOR信号通路异常激活的关键分子究竟是什么？在AS患者体内是否同样存在这种自噬减弱的情况？上述问题仍有待进一步研究。

Biography

Funding Statement

广东省自然科学基金（2018A0303130258）

References