Abstract
Objective
To observe the effect of uniform and shift rotation culture on the formation and activity of the alginate-chitosan (AC) microencapsulated HepLL immortalized human hepatocytes and HepG2 cells aggregates.
Methods
AC microcapsulated HepG2 and HepLL cells were randomly divided into two groups. Each group was divided into 3 subgroups according to uniform and shift rotation culture.The size and number of aggregates were observed and measured under laser confocal microscopy and inverted microscope dynamically. The amount of albumin synthesis was detected by ELISA, the clearance of ammonia was detected by colorimetry, and diazepam conversion function was detected by high performance liquid chromatography (HPLC).
Results
On day 6, 8, 10, 12, 14 and 16, the number and size of the aggregates, albumin synthesis, diazepam clearance and ammonium clearance increased significantly in shift rotation culture group than in uniform group (all
P
< 0.01). The albumin synthesis, diazepam clearance, and ammonium clearance in the microencapsulated HepLL groups were significantly higher than those of HepG2 cells at any time (all
P
< 0.01).
Conclusion
Shift rotation culture can significantly promote the formation and increase the activity of AC microencapsulated HepLL and HepG2 aggregates, and HepLL cells may be more suitable for bioartificial liver than HepG2.
Keywords:
Chitosan, Capsules, Hepatocytes/cytology, Culture media, Cells, cultured/cytology, Cell culture techniques/methods, Rotation
由于肝脏功能的多样性、结构的复杂性,在体外完全模拟肝细胞的生长微环境并在体外重建肝细胞的功能十分困难。微胶囊技术能为细胞提供一个有利于细胞组织重建的微环境，使细胞的形态接近于在体的组织。目前微囊技术已广泛用于生物人工肝研究
。我们前期的研究发现，海藻酸钠—壳聚糖(AC)微囊包裹可提高永生化人肝细胞HepLL培养白蛋白合成和清除氨、利多卡因能力
，肝细胞动态培养时，在施加的振荡或者是旋转等外力的作用下，肝细胞能够形成球形聚集体，而循环灌流系统又持续地为细胞提供了气体和养分，更有利于细胞的生长。
微囊细胞转瓶培养技术结合了微囊培养和转瓶培养的优点，有利于囊内细胞高密度、快速生长并合成和分泌活性物质，而HepG2细胞目前也广泛用于生物人工肝研究
。我们前期的研究发现,在0~4 r/min范围内，Bellco转瓶培养的微囊HepLL永生化人肝细胞、HepG2细胞随转速增加，细胞数目、白蛋白合成量、氨清除量、安定转化量均逐渐升高
，但是其细胞数和细胞功能仍无法满足临床需要。鉴于转瓶的转速难以进一步提高，本实验重点研究变速旋转培养的微囊HepLL、HepG2细胞聚集体数目和细胞活性能否较匀速旋转培养进一步提升，力图摸索出适合肝细胞高活性增长的最佳培养方式，为生物人工肝临床应用奠定基础。
DMEM高糖培养基、小牛血清(FCS)、碳酸氢钠、青霉素、链霉素、EDTA、胰蛋白酶均购自美国Gibco公司；海藻酸(Fluka No. 71238)、HEPES、MOPS、氯化钙、二甲基亚砜均购自美国Sigma公司；壳聚糖(>85%去乙酰化，黏度30~100 mpas，水溶性)购自中国山东省济南海得贝海洋生物工程有限公司；永生化人源性肝细胞HepLL由本室构建
；HepG2由浙江大学医学院附属第一医院肝胆外科研究室惠赠；Coulter-Z2购自美国Coulter公司；ELISA试剂盒购自美国Bethyl公司；比色法分析仪购自美国Sigma-Aldrich公司；高效液相色谱仪购自美国Agilent公司。
随机分为两大组：一步法AC包裹HepLL细胞和一步法AC包裹HepG2细胞，两大组按匀速旋转培养(转瓶转速均为4 r/min)、变速旋转培养(培养2 d或4 d后转速由2 r/min增加为4 r/min)分为三小组，最终实验分组为LY组(HepLL匀速旋转培养)、LB-A组(HepLL培养 2 d后转速由2 r/min增加为4 r/min)、LB-B组(HepLL培养4 d后转速由2 r/min增加为4 r/min)、GY组(HepG2匀速旋转培养)、GB-A组(HepG2培养2 d后转速由2 r/min增加为4 r/min)、GB-B(HepG2培养4 d后转速由2 r/min增加为4 r/min)。各组所包埋的细胞密度均为1.5×10
6
，各组初始细胞数目均为1.0×10
7
。各组分别取样进行形态学、超微结构观察，检测白蛋白合成、氨的清除量以及安定转化功能。
25%胰蛋白酶消化细胞，锥虫蓝染色检测细胞存活率，存活率大于95%，计数，加入1.5%海藻酸钠溶液，调整细胞密度为1.5×10
6
/mL，连接微胶囊发生器，调节参数使海藻酸钠形成均匀稳定的小液珠，液滴滴入终浓度为0.1 mol/L氯化钙、0.5%水溶性壳聚糖和13 mmol/L的HEPES溶液，持续搅拌30 min
，无血清DMEM高糖培养液洗涤三遍，微胶囊移入转瓶(1000 mL)，加入含10%FBS的DMEM高糖培养液200 mL培养(1×10
7
细胞/200 mL)。
按上述实验设计分组，微胶囊细胞部分置于转瓶培养仪上层匀速旋转培养，部分放到转瓶培养仪下层变速旋转培养，5%二氧化碳、37 ℃，DMEM高糖培养基(含10%胚胎新生牛血清、7 g/L碳酸氢钠，100 U/mL青霉素，100 μg/mL链霉素)，每48 h用细胞筛网过滤培养的微胶囊细胞，更换200 mL新鲜培养基，废弃培养基留样储存于-80 ℃冰箱。
分别于微胶囊包裹后2、4、6、8、10、12、14、16 d，随机称取10 mL微胶囊，弃去培养基，于0.1 mol/L柠檬酸盐、酸碱度 7.4、37 ℃孵育5 min，溶解囊膜，弃上清液；PBS重复清洗三次，弃上清液，加入少许含10%FBS的DMEM高糖培养基，Coulter-Z2计数器计数聚集体数目和聚集体直径
。之后PBS重复清洗三次，弃上清液，600 r/min离心10 min，HE染色观察细胞形态，锥虫蓝染色检测细胞活力，血细胞计数仪检测细胞数目，计数结果乘以20即为当日该组微胶囊细胞总数，每组实验重复三次，最后结果取平均值。
1.5中废弃培养基留样采用ELISA检测白蛋白合成量[单位pg/(cell·h)]，每组实验重复三次，最后结果取平均值。其中胚胎新生牛血清所含的白蛋白不会与ELISA试剂盒所用的抗人白蛋白抗体交联。
每48 h用细胞筛网过滤培养的微胶囊化细胞，弃去旧培养基，用等渗氯化钠溶液洗涤三遍，加入含1 mmol/L 氯化铵的无血清DMEM高糖培养液，37 ℃转瓶培养2 h。取上清液用比色法检测氨的浓度，每组实验重复三次，最后结果取平均值。
每48 h用细胞筛网过滤培养的微胶囊化细胞，弃去旧培养基，用等渗氯化钠溶液洗涤三遍，加入含5 μg/L安定的无血清DMEM高糖培养液，37 ℃转瓶培养2 h。取上清液用HPLC法检测安定浓度。
实验数据误差范围均在2%以内，结果以均数±标准差(
s
)表示，采用Excel 2003和SPSS 11.5统计学软件处理，组间比较采用重复测量的方差分析，以
P
<0.05为差异有统计学意义。
2,
*
